Me rëndësi të madhe në zhvillimin e virologjisë ishte futja e metodave të kultivimit të virusit në embrionet e pulave. Për riprodhimin e virusit, embrion pule 7-12 ditësh, inkubuar në një termostat në 37 C. Parakusht për zhvillimin e duhur të embrionit, po vëzhgon lagështi të caktuar, të cilat mund të krijohen duke vendosur një anije me ujë në ujë termostati. Kultivimi i viruseve në embrionet e pulave kryhet në vende të ndryshme të embrionit, të cilat infektojnë:
1) në shell Chorion-Allantomic;
2) në zgavrën alablike;
3) në zgavrën amniotike;
4) në çantën e verdhë.
Infeksioni i embrioneve të pulave kryhet në boks duke përdorur mjete sterile. Para: Infeksioni, embrionet e pulave të fshihen dyfish me një shtupë pambuku, të lagur me alkool.
Infeksioni në shell Chorion-Allantomic. Pas dezinfektimit, vezët prerë butësisht një copë predha nga një suckid skadon, hiqni një shell superal - në të njëjtën kohë shell Chorion-Aastik është zbuluar. Materiali infektiv në një shumë prej 0.1-0.2 ml me një shiringë ose pipetë parser aplikohet në predhë të Chorion-Allantomic. Pas infeksionit, kapaku është i hapur dhe lumen midis tij dhe embrionit të pulave është derdhur me parafine. Në anën tjetër të vezës, një laps i thjeshtë është shkruar emrin e materialit infektiv dhe datën e infeksionit.
Infeksion në zgavrën amniotike.Veza është ovinking dhe në anën e anës zgjidhni një komplot ku Chorion-Allantois është i privuar nga enë të mëdha të gjakut. Kjo faqe festohet me një laps. Vezët vendosen në një qëndrim në një pozicion horizontal, dezinfektoni dhe shtizë të veçantë steril shpojnë një vrimë dheshell në një thellësi prej 2-3 mm, përmes së cilës gjilpërë me materiale infektive futet direkt në zgavrën amniotike. Në mënyrë që lëngu i injektuar të mos rrjedhë mbrapa, para-të bëjë një shpatë mbi qese ajrore. Pas kësaj, të dy vrimat derdhen me parafine.
Infeksion në zgavrën allantomike.Infeksioni prodhon dhe boks shaded. Hapësira ajrore është vërejtur, shell mbi hapësirën ajrore është dezinfektuar dhe përmes vrimës në guaskë është futur në drejtim të gjilpërës embrion të shiringës me materialin. Nëse gjilpëra ra në zgavrën allantomike, atëherë është vërejtur zhvendosja e embrionit. Pas infeksionit, vrima derdhet me parafine.
Infeksioni, në çantën e verdhë.Shell dezinfektoj. Veza është vendosur në qëndrim me një fund të hapur në të djathtë në mënyrë që tags gusty janë kthyer deri. Mbi dhomën e ajrit në qendër shpërtheu një vrimë. Nëpërmjet një vrima në guaskë në shell në një drejtim horizontal në një thellësi prej 2-3 mm, një gjilpërë shiringë është futur, e cila bie në çantën e verdhë. Materiali është injektuar në një vëllim prej 0.2-0.3 ml. Pas injektimit të materialit, vrima është parafining.
Regjimi i temperaturës dhe kohëzgjatja e inkubacionit varet nga vetitë biologjike të këtij virusi. Vezët e infektuara kontrollohen çdo ditë, të haggard për testimin e qëndrueshmërisë së embrionit. Nëse embrionet humbin në ditën e parë, arsyeja për këtë zakonisht është plagosur në infektimin. Vezë të tilla rrjedhin nga përvoja. Prania e një virusi në embrionin e infektuar përcaktohet nga ndryshimet karakteristike në guaskë alantike të një embrioni të infektuar të pulave. Viruset që nuk kanë aktivitete hemagotinë janë zbuluar duke përdorur RSK. Për të identifikuar virusin në lëngje allantike ose amniotike të embrioneve të infektuara të vendosura RGA.
Shumica e viruseve të njohura kanë aftësinë për të shumëfishuar në një embrion pule (Fig. 4). Embrionitë e moshës 8 deri në 14 ditë përdoren në varësi të llojit të virusit, metodës së infektimit dhe detyrave të studimit. Viruset e influenzit kultivohen në 9-10, vaksina ops - në 12, vapotiti - në embrionet e pulave 7-ditore. Riprodhimi i virusit në embrionet e pulave ndodh në pjesë të ndryshme të embrionit, e cila është e lidhur me veçoritë e tropizmit të virusit. Metoda e kultivimit të virusit në embrionin e pulave përdoret gjerësisht në kultivimin industrial.
Struktura e embrionit të pulave dhe metodat e infeksionit të saj: 1 - në amnion; 2 - në zgavrën allantomike; 3 - në qese të zymtë. (Mikrobiologjia dhe imunologjia. Redaktuar nga Vorobiev A.A. - M. - 1999).
Shelli më i rastësishëm i rastësishëm në botë, ngjitur me shell ose pëlhura të nënës dhe për këtë arsye i shërbejnë vendit të këmbimit midis embrionit dhe mjedisit që e rrethon atë, quhet Chorion.Në specie, vezët e vendosura, funksioni kryesor i Korionit është zbatimi i shkëmbimit të gazit të frymëmarrjes. Në gjitarë, Chorion është i përfshirë në frymëmarrje dhe të ushqyerit, izolimin, filtrimin dhe sintezën e substancave. Në organizmat primitivë, Chorion është një guaskë sekondare, dhe zarf i avancuar i fetusit. Zgavrën midis Chorion dhe Amnion është Chorionniotik.
Amnion(Greke, amnion), një qese amniotike ose shell ujor është një nga embrionet e embrioneve të zvarranikëve, zogjve, gjitarëve.
Amnion evolucionar u shfaq për të mbrojtur embrionet nga tharja gjatë zhvillimit jashtë mediumit ujor. Prandaj, kafshët vertebrale që po shtyjnë vezët (zvarranikët dhe zogjtë), si dhe gjitarët që kanë ndodhur nga zvarranikët i përkasin grupit amniotë ("kafshët me predha vezë"). Klasat dhe vertebrorët e mësipërm (bishtin, headlamp, peshku, amfibët) po hedhin havjar në mjedisin ujor, kështu që ata nuk kanë nevojë për një guaskë uji. Këto klasa të kafshëve janë të kombinuara në grupin e Anamit. Ndryshe nga Anaman, Amniotam nuk kërkon një medium të ujit për mbarështimin dhe zhvillimin e hershëm, prandaj, amniojet nuk janë të lidhura me trupat e ujit. Kjo përbëhet nga një rol evolucionar të amnionit.
Gjatë lindjes së gjitarëve, shell shell shpërthen, uji rrjedh jashtë, dhe mbetjet e amnionit në trupin e porsalindur shpesh quhen "këmishë", e cila është kudo për një kohë të gjatë është shenja e fatit të mirë dhe Supersticione të tjera (prandaj, në veçanti, rus duke thënë për ata që "në Shurbach të lindur").
Allantois (nga greqishtja. Allantoeid? S - Suxhuk) është trupi embrional i frymëmarrjes së vertebrorëve më të lartë; Një guaskë embrion që zhvillohet nga mbrapa e embrionit. Përveç kësaj, Allantois merr pjesë në shkëmbimin e gazit të embrionit me mjedisin dhe lirimin e mbeturinave të lëngshme. Allantois, së bashku me predha të tjera embrionale - amnion dhe Chorion, është një shenjë përcaktimi i vertebrorëve më të lartë - gjitarë, zogjve dhe zvarranikëve.
Në zogjtë dhe zvarranikët e vezëve, Allantois zhvillohet rreth embrionit përgjatë mureve të guaskës. Në shtresën e saj të jashtme, të quajtur Mesoderm, krijon një rrjet të gjerë të enëve të gjakut, me të cilin zhvillohet ndërveprimi me mjedisin e jashtëm. Në gjitarë, Allantois është pjesë e kordonit të kërthizës.
Ka disa mënyra për të infektuar embrionin e pule në zhvillim: në shell Chorionallant, në zgavrën alablike dhe amniotike, qese të zymtë, trupin e embrionit.
Infeksioni për shell Chorionallant është përdorur për të izoluar dhe kultivuar viruset që formojnë pllaka në predha (viruset e vaksinave, pjesët natyrore, herpes të thjeshta). Para infeksionit, vezët zhvendosen me një kulture, laps është përcaktuar nga kufiri i hapësirës ajrore dhe shell Chorionallant. Sipërfaqja e vezës mbi hapësirën ajrore dhe në vendin e infeksionit fshihet me alkool, djeg, përpunuar me jod dhe të bëjë një vrimë në zgavrën e qeseve të ajrit.
Në vendin e infeksionit, shell është hequr në mënyrë që të mos dëmtojë shell suprem, i cili pastaj shpohet me një gjilpërë të shkurtër steril, në mënyrë që të mos dëmtojë shell Chorionallant. Gjiri i naftës ajrore gjiri. Materiali viral (0.05 - 0.2 ml) zbatohet në shell Chorionallant me një shiringë tuberkuloze me një gjilpërë të shkurtër ose pipetë pasteur. Vrima në guaskë është e mbyllur me xham të veshjes sterile ose të njëjtën copë predhë të copëtuar dhe parafine e shkrirë është derdhur përgjatë skajeve. Embrionet e infektuara janë të vendosura në qëndrim horizontalisht dhe inkubohen në termostat. Embrionet embossing është kryer jo më herët se 48 orë inkubacion. Në një shell të infektuar, njollat \u200b\u200be errët me sy të bardhë të formave të ndryshme (pllaka).
Infeksioni Allantik i zgavrës. Virusi i futur në Allantois shumëfishohet në qelizat endodermale, pastaj duke kaluar në lëngun allantomik. Infeksioni kryhet në mënyrën e mëposhtme: në shell mbi dhomën e ajrit, buza e bisturi ose gërshërë prodhojnë birë, pas së cilës gjilpërë me një shiringë është futur përmes vrimës në drejtimin vertikal, i cili kalon përmes shell-it korional Dhe hyn në zgavrën alablike, materiali futet në volumin prej 0.1 ml dhe parafine e vrimës derdhur.
Qese të përgjumur. Për këtë qëllim, përdoren embrionet 5 - 10 ditë. Dy metoda të infeksionit janë më të zakonshmet. Në materialin e parë futet përmes hapësirës ajrore. Në qendër të vezëve të bëjë një vrimë, vendoseni në qëndrim me një fund të hapur në të djathtë dhe nëpër vrimë në drejtimin vertikal, gjilpërë është futur, u përkul në shiringë, gjilpërë kalon nëpër shell Chorionallant, zgavrën allantomike në yolk. Ju mund të hyni nga 0.1 në 0.5 ml materiale që përmbajnë virus në qese të zymtë. Pas infeksionit, vrima në guaskë derdhet me parafine, dhe embrioni vendoset në termostat. Sipas metodës së dytë në kufirin e hapësirës ajrore nga ana tjetër, ku të verdhë veze (palët që kundërshtojnë nga embrioni) është bërë nga shpimi i guaskës përmes së cilës është injektuar materiali infektiv. Drejtimi i gjilpërës duhet të jetë në qendër të vezës.
Një embrion pule e infektuar me material viral vënë në një inkubator për 2-3 ditë, në varësi të natyrës së virusit të hyrjes. Për zhvillimin e viruseve nga mostrat e marra në një pacient (për shembull, wasches nasopharynx të përdorura në diagnostikimin e influencës), një embrion pule përfaqëson një mjedis të mirë. Sipas llojit të ndryshimit, le të themi në indet e shell Chorionallant, ju mund të përcaktoni direkt se si me të cilën kemi të bëjmë me virusin. Ndryshime shumë karakteristike japin viruse të veglave dhe herpes. Disa viruse janë shumë të shumëzuara në indet e ndryshme të embrionit të pulave dhe sigurojnë material fillestar për përgatitjen e antigjeneve virale të kërkuara me diagnozën laboratorike të sëmundjeve virale. Viruset e riprodhuara në embrionin e pulave u përdorën si material fillestar për marrjen e tetëmbëdhjetë llojeve të vaksinave të vaksinave.
Përkundër aspekteve pozitive të kulturave të qelizave që kanë marrë një të tillë të përhapur në laboratorët modern virologjik, embrioni i pulave në shumë raste ka ruajtur vlerën e saj primare dhe vazhdon të shërbejë si një material klasik për punë. Dekompozimi i virusit në embrionin e pulave është bërë nga vdekja e embrionit, reagimi pozitiv i hemaglutinimit në xhami me lëngun alikt ose amniotik, me formimin e lezioneve fokale ("pllaka") në predhë korion-alban, si dhe në RGA.
Objektiv: Njohni studentët me metoda për infeksionin e embrioneve të pulave për kultivimin e virusit.
Pajisjet dhe materialet: Embrionet e pule 9-12 ditë inkubacioni i moshës, ovoskop, tamponët e alkoolit, qëndron për embrionet, piskatore, gërshërë, telestownlasty, hala, shiringa, lapsa të thjeshta, pobbiers, hala, tavolina, skema, pajisje multimediale, prezantime MS Office Power Point në temën e klasave.
Ndikon ndjeshëm riprodhimin e viruseve në metodën e embrionit të infeksionit. Para infeksionit, vezët e inkubuar pro-bust, të vdekurit janë të ndara. Në guaskën e vezëve me embrione të gjallë, të cilat ata dallojnë midis ngjyrës së kuqe të enëve të gjakut dhe lëvizjes së embrionit, laps është shënuar nga vendi i infeksionit.
Infektojnë embrionet në kutinë sterile, që ka një desktop, dy tabumen, furnizim me gaz, furnizim me ujë dhe vakum. Infeksioni në zgavrën amniotike kryhet në një dhomë të errët. Vendi i punës duhet të jetë i ndriçuar mirë. Para se të punoni në tryezë dezinfektoni. Për dezinfektimin e sipërfaqes së vezëve, merret një zgjidhje antiseptike (70% alkool, 2% zgjidhje jodike) dhe një shkop prej druri të mbështjellë, përkulur sondën dentare ose ngacmues për shpimin e guaskës së vezës. Vezët janë të infektuar me shiringë sterile për tuberkulinizimin dhe hala të veçanta. Vendi i infeksionit në vezë është derdhur me parafine. Për këtë, janë përgatitur shkopinj parafine: një shkop xhami futet në tubin e provës, një shkop xhami, ndiqni se është në qendër të tubit të provës në ftohjen e parafinës.
Kur nevojitet parafine shkopi, muret e tubave të testimit janë të nxehta në hekurudhë dhe parafine nga tubi është tërhequr pas shkopit të qelqit. Mbajtja e një shkopi mbi flakën, ne Melm numrin e parafine të nevojshme për të mbyllur vrimën në vezë. Kjo metodë është shumë e pastër, dhe palët e Paphin nuk janë formuar.
Përveç kësaj, një gotë me shtupë pambuku sterile është vendosur në desktop në kutinë, një gotë me një zgjidhje 3% sode kaustike për mjetet e përdorura dhe një zgjidhje me një zgjidhje të klorit për sendet e përdorura të grumbullimit. Në rastin e nevojës, ju mund të përgatisni një mbështetje për vezët, një filxhan të vogël të emaluar dhe media sterile ushqyese. Desktop i përgatitur në këtë mënyrë për 1-2 orë i nënshtrohet rrezatimit UV.
Duke pasur parasysh patogjenitetin e viruseve nën studim, puna çon në një maskë, doreza gome dhe syze mbrojtëse.
Ka gjashtë metoda të infeksionit embrion. Infeksioni më i zakonshëm në zgavrën allantike dhe në shell Chorionallant, më rrallë - në zgavrën amniotike dhe në qese të zymtë dhe në mënyrë të rrallë - në trupin e embrionit dhe në enët e gjakut të Hao. Zgjedhja e metodës përcaktohet nga tropizmi i virusit, si dhe qëllimi i infeksionit. Me çdo metodë të infeksionit, 0.1-0.2 ml materiale infektive është futur.
Kur infektuar me këtë metodë, viruset e influencës, sëmundjet e Newcastle, ropneumonia e kuajve, stomatiti vesikik, etj Ka disa variante të metodës. Ka disa variante të metodës.
Opsioni i parë.Embrioni është fiksuar nga një fund vertikalisht i hapur. Në predhë në anën e embrionit, dhe nganjëherë me germin e kundërt, pala e 5-6 mm mbi kufirin e dhomës së ajrit të bëjë një vrimë me një diametër prej rreth 1 mm. Gjilpëra është futur paralel me aksin gjatësor në një thellësi prej 10-12 mm (Figura 16). Pas injektimit të materialit që përmban virus, gjilpërë hiqet, dhe vrima në guaskë mbyllin rënien e parafinës sterile të shkrirë.
Figura 16. Infeksioni në zgavrën alablike (opsioni i parë) (në Nikolau)
Opsioni i dytë.Vrima e bërë në guaskë mbi dhomën e ajrit përdoret vetëm për të dalë nga një pjesë e ajrit. Hapja për vetë infeksionin është bërë në vendin e zonës sëvoluese të shell Chorionallant (Hao) nga ana e embrionit. Gjilpërë është futur në një thellësi prej jo më shumë se 2-3 mm. Injektoni lëngun infektiv në një vëllim prej 0.1-0.2 ml dhe mbyllni vrimën me parafine (shih Fig. 17).
Kjo metodë e infektimit të embrioneve të pulave është më shpesh e përdorur për kultivimin e viruseve epitelotropike dhe pantrobike të linjave të vogla, lyerngotracheitis të zogjve, plagë të mishngrës, sëmundjeve të AUSA, catarrhal, dele, etj.
Një infeksion i tillë mund të kryhet përmes një dhome ajrore natyrore ose artificiale.
Për infeksion përmes dhomës ajrore natyroreembrioni është vendosur në një trekëmbësh vertikalisht në fund të fundit dhe në guaskë kundër qendrës së ajrit, është prerë një dritare e rrumbullakët me diametër prej 15-20 mm. Nëpërmjet kësaj dritare, piskatore heqin një predhë të mrekullueshme. Një pezullim me virus prej 0.2 mm është aplikuar në pjesën e zhveshur të Hao (Figura 18), vrima është e mbyllur me një leakoplasty ose më pak shpesh me xhamin e veshjes, duke forcuar atë me parafine të shkrirë.
Infeksion përmes dhomës artificiale të ajritaplikoni më shpesh se sa i pari, pasi siguron kontaktin e materialit që përmban virus me një sipërfaqe më të madhe të Hao dhe, për këtë arsye, çon në formimin e më shumë virusit.
Figura 17. Infeksioni i një embrioni pule në një zgavër alantike (opsioni i dytë) (në Nikolau)
Figura 18. Infeksioni në HAO përmes Dhomës Natyrore të Ajrit (sipas Nikolau, etj)
Figura 19. Infeksioni i një embrioni pule në Hao përmes një dhome ajrore artificiale (në Nikolau, etj)
Për të infektuar embrionin, kjo metodë është vendosur në një trekëmbësh horizontalisht embraing deri. Dy vrima janë bërë në guaskë: një të vogël mbi qendrën e dhomës së ajrit (të destinuara për thithjen e ajrit prej saj), dhe një tjetër me një diametër prej 0.2-0.5 cm në anën tjetër, nga ana e embrionit. Kompleksiteti i metodës është se, duke e bërë vrimën e dytë, është e nevojshme që me kujdes të hiqni pjesën e guaskës në fillim, pastaj lëvizjen rrëshqitëse, pa dëmtuar hao, lëvizni shell superal në anën tjetër në mënyrë që ajri të mund të kalojë nëpërmjet defektit që rezulton. Pas kësaj, dardha e gomës përmes vrimës së parë është thithja e ajrit nga dhoma e ajrit natyror (Figura 19, A). Në rezultatin, ajri i jashtëm nxiton brenda hapjes anësore, duke formuar një dhomë artificiale të ajrit, në fund të e cila është Hao (Figura 19, b).
Nëpërmjet vrimës anësore në sipërfaqen e Hao, aplikohet lëngu infektiv dhe vrima është e mbyllur me një copë ngjitës. Për të mbyllur vrimën e parë nuk është e nevojshme, pasi fletushka e brendshme e shellit të pahijshëm në të njëjtën kohë metoda e infeksionit nuk është shkelur dhe vazhdon të kryejë rolin e barrierës për mikroflorën.
Inkubacioni i mëtejshëm i embrioneve të infektuara me këtë metodë kryhen në një anë të pozicionit horizontal të pozicionit.
Për riprodhimin e klamidisë, ato përdoren kryesisht për mbarështimin e klamidisë, si dhe viruset e sëmundjes Marek, ropneumonia e kuajve, ethet e dele, etj. Infektojnë embrionet 5-7 ditë dhe nganjëherë 2-3 ditë ( Valley Valley Valley Valley). Përdorni dy variante të infeksionit.
Opsioni i parë.Embrionet vendosen në një trekëmbësh në një pozicion vertikal. Bëni një vrimë në guaskë mbi qendrën e dhomës së ajrit dhe futni gjilpërën në një thellësi prej 3.5-4 cm në një kënd prej 45 ° në boshtin vertikal në drejtimin e kundërt me vendndodhjen e embrionit (Fig. 20) .
Figura 20. Infeksioni i embrionit të pulave në qesen e verdhë (sipas Nikolau, etj)
Opsioni i dytë.Ndonjëherë një rrugë e ngjashme e infeksionit kryhet në embrion horizontalisht të fortifikuar në një trekëmbësh; Në të njëjtën kohë, embrioni është në fund, dhe vezull mbi të. Vrima në guaskë mbyll pjesën e parafinës së shkrirë.
Për këtë qëllim, përdoren embrionet 6 - 10 ditë. Metoda është përdorur në kultivimin e viruseve të influencës, sëmundjes Newcastle, kuaj ropneumoni, etj Ka dy mënyra të infeksionit.
Metoda e mbyllur.Infeksioni kryhet në një kuti të errët. Veza është vendosur në një ogoscope në një pozicion horizontal që embrion deri. Nëpërmjet vrimës në shell mbi avionë, një gjilpërë është futur me një fund të hapur drejt germin. Dëshmi se gjilpërë depërtoi amnionin, lëvizjen e trupit të embrionit në drejtim të lëvizjes.
Metoda e hapur.Shell mbi dhomën e ajrit është prerë në mënyrë që një dritare e formuar me një diametër prej 1.5-2.5 cm. Nëpërmjet tij, një guaskë e shëndoshë hiqet nga një piskatore nën kontrollin e syrit. Pastaj piskatore anatomike (14 cm) me degë më të ngushta, duke shtypur shell chorionallant drejt germin. Kur piskatore e arrijnë atë, degët janë të paqarta, kapni shell amniotik me Hao dhe tërhiqni deri në dritare. Mbajtja e piskatoreve të majtë me një guaskë të caktuar të amnionit, futet një material që përmban virus (Fig. 21). Më tej, të gjitha predhat janë ulur, dritarja është e mbyllur me një leukoplastikë dhe embrion inkubohet në një pozicion vertikal.
Figura 21. Infeksioni i një embrioni pule në Annion në një mënyrë të hapur (sipas Nikolau, etj)
Kur heososcopying embrioneve 11-13 ditë, vërehet një enë e madhe gjaku. Sipas tij, komplot shell hiqet, 1-2 pika të alkoolit janë aplikuar, gjë që e bën një predhë të mrekullueshme të transparencës për një kohë. Nën kontrollin e syrit në një altoskop, gjilpëra futet në një anije, e cila konfirmohet nga lëvizshmëria e saj me lëvizjet e vogla të gjilpërës. Komploti i zhveshur i një shell suprem është i mbyllur me një copë ngjitës.
Është e mundur të hyni në materialin në enët dhe në një mënyrë paksa të ndryshme: ata presin guaskën mbi dhomën e ajrit, predha e thithjes është e lidhur me alkoolin dhe materialin që është bërë anijet e dukshme janë injektuar. Vrima është e mbyllur me një copë ngjitës sterile.
Teknikat teknike të përshkruara të infeksionit eksperimental të embrioneve të pulave nuk janë të vetmet, por kanë mundësi të ndryshme.
Për infeksion, përdoren embrionet 7-12 ditë të moshës. Dihen dy variante të metodës.
Opsioni i parë.Ata janë të infektuar në të njëjtën mënyrë si në amnion në një mënyrë private, me ndryshimin e vetëm që ata marrin një gjilpërë akute dhe në oskopope, vëzhgimi i lëvizjeve të gjilpërës duhet të konsiderohet si një tregues i gjilpërës në trup.
Opsioni i dytë.Ata infektojnë të njëjtën mënyrë si në një mënyrë të hapur: përmes dritares në shell shtrëngon trupin e embrionit në guaskë. Materiali futet në tru ose pjesë të caktuara të trupit. Me metoda të tilla të infeksionit, ekziston një përqindje e konsiderueshme e vdekjes jo-specifike të embrioneve.
Para inkubacionit të mëtejshëm në shell të infektuar me ndonjë metodë të embrioneve të pulave, është shkruar një laps i thjeshtë (grafik) sesa një embrion i infektuar dhe kur, dhe nëse është e nevojshme, informacione të tjera. Embrionet e pulave të infektuara vendosen në një termostat për inkubacion të mëtejshëm, gjatë së cilës ndodhin riprodhimi i viruseve dhe akumulimi i tyre në strukturat përkatëse ndodhin. Temperatura e inkubacionit të embrioneve varion nga 33 në 38 ° C, në varësi të pronave të virusit, gjë që shkaktoi infeksion. Për embrionet, ka mbikëqyrje të vazhdueshme, duke shfletuar në një oskoskop, duke zgjedhur rënien.
Vdekja e embrioneve në 24 orët e para pas infeksionit është më shpesh për shkak të riprodhimit të kërpudhave, mikroflora bakteriale, hyri në embrion së bashku me inokulum ose lëndim në infektimin. Kjo vdekje konsiderohet jo specifike. Në datat e mëvonshme, embrionet po vdesin si rezultat, si rregull, mbarështimi në embrionin e virusit. Duke gjetur embrionet e vdekura, ata transferohen menjëherë në frigorifer me një temperaturë prej 4 ° C. Kushtet e tilla, nga njëra anë, kontribuojnë në ruajtjen e veprimtarisë së akumuluar në embrionin e virusit, nga ana tjetër - vulën e indeve dhe nisjen e anijeve, të cilat lehtësisht lehtësojnë autopsinë pasuese.
Embrionet inkubohen deri në akumulimin maksimal të virusit. Për çdo virus dhe madje edhe tendosje, kjo periudhë është përcaktuar dhe ndryshon nga 2 në 7-8 ditë. Pra, për virusin e sëmundjes Newcastle, tendosja H, është 2-3 ditë, për të njëjtin virus të tendosjes, - 5 ditë, për virusin e lyers infektive të zogjve - 5 ditë, etj. Pastaj të gjitha embrionet janë vrarë duke ftohur në 4 ° C për të paktën 3-4 orë dhe të hapura.
Metoda e OZN është heqja e embrionit nga veza në periudhën kur shell chorionallantical është plotësisht ngjitur me guaskën e saj nga brenda. Nëse shtoni një medium lëndë ushqyese brenda një veze të tillë, atëherë formon një kulturë të veçantë të indeve në të cilën virusi mund të shumëzohen. Metoda ka një numër përparësish: Kjo ju lejon të merrni një virus më të pastër sesa në lëngun Allen-Amniotik, i cili është i rëndësishëm për të zvogëluar vetitë alergjike të vaksinave të përgatitura nga ky material; Mungesa e një qese të verdhë dhe, për rrjedhojë, antitrupa specifike të përfshira në të bën të mundur për të shumëfishuar më mirë nga disa viruse. Në disa raste, kjo metodë jep rezultate të mira në punën diagnostike, pasi që përmban sasi të mëdha të materialit nën studim, gjë që rrit mundësinë e ndarjes së virusit.
Metoda e propozoi Bernopop përsëri në vitin 1949, por për shkak të vështirësive të përdorimit nuk është përdorur gjerësisht. Këto vështirësi janë të lidhura me pronën e shell Chorionallant në procesin e inkubacionit të ndarë nga guaska, e cila redukton vlerën e kulturës dhe e bën të vështirë të manipulojë marrjen e virusit dhe zëvendësimin e mediumit të vogël.
E. Groel (1963) paraqiti një numër ndryshimesh që i lejonin këto vështirësi për të eliminuar. Ai sugjeroi përdorimin e vezëve 15-ditore dhe madje edhe më të vjetra, të cilat në procesin e inkubacionit duhet të kthehen shpesh për zhvillimin uniform të guaskës në vezë. Kur të tejdukshëm, tregoni kufijtë e dhomës së ajrit. Shell është derdhur nga 0.5 cm mbi këtë linjë, parafine e shkrirë (56-58 s °) derdhet në buzë të shell shell (56-58 s °), e cila është e ngrirë, rregullon skajin e vezëve. Pastaj vrima e rrumbullakët në guaskë mbi embrionin, duke lënë rreth një rim të ngushtë. Faza tjetër është heqja e kujdesshme e embrionit nga veza. Në këtë rast, veza duhet të mbahet në një pozicion horizontal dhe të rrotullohet ngadalë. Në këtë mënyrë, janë gjetur enët, lidhjen e embrionit me Haa, dhe i prerë me gërshërë. Nëse veza është për të mbajtur vertin, atëherë embrion tërheq shell me masën e saj, duke e copëtuar zakonisht në zonën e fund të mprehtë të vezës. Edhe një sasi e vogël e lëngjeve midis Hao dhe Shell shkakton një shkëputje të plotë shell për 1-2 ditë.
Pas heqjes së embrionit, guaska, rreshtimi i vezës, përsëritet disa herë me një zgjidhje fiziologjike të ftohur në 4-0 ° C, derisa lëngu të bëhet transparent. Pastaj, 20 ml medium lëndë ushqyese u prezantua në zgavrën e vezës, të nxehtë në 37 ° C, dhe veza është e mbyllur me një kapak gome sterile, pasi e zhytur atë në parafine. Një tub gome, i montuar në një vezë, siguron marrjen dhe futjen e një lëngu pa rrezikun e kontaminimit bakterial. Një objekt i tillë biologjik mban vitalitet brenda pak ditësh.
Sipas metodës së Yoshino dhe të tjerëve, zgavra e vezëve të demubruara është e mbushur me një zgjidhje agar në zgjidhjen e Henksa. Infektojnë vezët e konsideruara përmes tubit në kapak.
Pyetjet e kontrollit:
1. Struktura e embrionit të pulave.
2. Cilat janë përdorimi i embrioneve të pulës në virologji?
3. Cila është struktura e një embrioni të pulave në zhvillim?
Embrionet përdorin moshën 8 deri në 14 ditë në varësi të llojit të virusit, metodën e infeksionit. Riprodhimi në embrion pule ndodh në pjesë të ndryshme të embrionit. Promovimet e infeksionit: në shell Chorionallant, në një qese allotoike dhe amniotike, të zymtë, trupin e embrionit.
Në varësi të teknikës së përgatitjes së 3 llojeve të qelizave:
Një shtresë e vetme mund të shumëzojë në sipërfaqen e xhamit neutral kimikisht në formën e monolayer;
Pezullimi, i thyer në të gjithë vëllimin e mediumit lëndë ushqyese;
Organi-një copë pjesë të organeve dhe indeve që mbajnë strukturën origjinale.
Përgatitja e kulturës primare të qelizave të palosur nga disa faza: bluarja e indeve, shkyçja e qelizave, pastrimi i pezullimit që rezulton nga trypsin.
Treguesi:
- ndryshimet morfologjike të qelizave të veprimit të citopatikëve nën mikroskop, deri në refuzimin e qelqit.
Përfshirjet virale janë akumulimi i grimcave virale ose ndarjes së komponentëve të virusit në një citoplazmë ose thelb të qelizave.
Zonat e kufizuar të Balax-it përbëhen nga qeliza degjeneruese. Ato janë të dukshme si pika të lehta në sfondin e qelizave të pikturuara.
Test me ngjyra
Hemadsorption - aftësia e kulturave qelizore për adsorb në qelizat e saj të kuqe të gjakut.
Ndërhyrje.
Bakteriofagët e baktereve që kanë aftësinë për të depërtuar në qeliza bakteriale, shkaktojnë shpërbërjen e tyre. Ata kanë një formë të kokës, disa forma të filamentozëve kub. Përbëhet nga një kokë ikosahedral dhe proces bisht. Brenda procesit të bishtit, shufra cilindrike, furrë, procesi përfundon me një pjatë bazale gjashtëkëndore me spikes të shkurtër. Phages përbëhen nga acid nukleik dhe proteina. Në fazat që kanë një formë të spermës, një ADN bunk është e mbushur fort në formën e një spirale brenda kokës. Proteinat janë pjesë e guaskës. Përveç proteinave strukturore, proteinat e brendshme gjenden të lidhura me acidin nukleik dhe proteinat-enzimat e përfshira në ndërveprimin e fagit me një qelizë.
Phages virtuble mund të rriten vetëm në sasinë përmes një cikli lithik. Procesi i ndërveprimit midis bakteriofagës virulent me një qelizë përbëhet nga disa faza: adsorption e bakteriofage në një qelizë, depërtimit në qelizë, biosintezën e komponentëve të fagut dhe kuvendit të tyre, daljes së bakteriofagëve nga qeliza.
Fillimisht bakteriofagët i bashkëngjiten receptorëve fagostik në sipërfaqen e qelizës bakteriale. Bishti i fagut me ndihmën e enzimeve në fund të saj (kryesisht lizozyme) shpërndan në nivel lokal, zvogëlohet dhe gjendet në kokën e ADN-së, është injektuar në qelizë, ndërsa mbështjellja e proteinave të bakteriofagëve mbetet jashtë. ADN e prekur shkakton një riorganizim të plotë të metabolizmit të qelizave: sinteza e ADN-së bakteriale, ARN dhe proteinat ndalen. ADN-ja e bakteriofagut fillon të transkriptojë duke përdorur transkriptazën e saj enzimë, e cila, pas hyrjes në qelizën bakteriale është aktivizuar. Në fillim, dhe pastaj vonë IRNN, të cilat vijnë në ribozomet e qelizës pritëse, ku është e hershme (polimeraza e ADN-së, nucleases) dhe me vonesë (proteina të kapakut dhe zgavrës, enzimat lizozim, atfase dhe transkriptaz) janë sintetizohen. Replikimi i ADN-së bakteriofage ndodh përmes mekanizmit gjysmë donservator dhe kryhet me pjesëmarrjen e ADN-së të vet polimeraz. Pas sintezës së proteinave të vonuara dhe përfundimit të replikimit të ADN-së vjen procesi përfundimtar - ripening i grimcave fag ose lidhja e ADN-së fag me proteina shell dhe formimin e grimcave të pjekura fage infektive.
Shiko gjithashtu:
|
Shumë viruse që prekin njerëzit dhe kafshët mund të shumëzohen kryesisht në një embrion pule. Prania e një shell të dendur mbron embrionin nga lidhja e mikroorganizmave nga mjedisi i jashtëm.
Metoda e kultivimit të viruseve në embrionet e pulave përdoret me diagnozën laboratorike të infeksioneve virale, si dhe për prodhimin e vaksinave virale dhe përgatitjeve diagnostike. Por kjo metodë ka të meta: 1) Është e pamundur të vëzhgoni në dinamikën e ndryshimeve patologjike që ndodhin në embrionin pas infeksionit me virusin; 2) në hapjen e embrionit të infektuar me virusin, shpesh nuk zbulohen ndryshime të dukshme dhe është e nevojshme të identifikohen praninë e një virusi në indet në lëngje embrioni, duke përdorur metoda të tjera virologjike (për shembull, reagimi i hemaglutinimit); 3) Metoda e kultivimit në embrionet e pulave nuk është e përshtatshme për të gjitha viruset. Përkundër mangësive ekzistuese, metoda është relativisht e thjeshtë, e përshtatshme dhe e lirë dhe përdoret gjerësisht në studimet virologjike. Ajo ka kuptimin më të madh kur punon me olteriksovirus, herpesviruses, poksvirus.
1.3.1. Struktura e embrionit të pulave
Embrioni pule është i mbuluar me një guaskë gëlqere - një predhë, në të cilën predha është ngjitur nga brenda. Në fund të hapur të vezës, ajo ndan dhe përfshin hapësirën ajrore. Nën shell shell ka një shell chorionallant, në fund të hapur të vezës, ajo kalon përgjatë brendësisë së guaskës, mbyllja e hapësirës ajrore, kjo shell është e pasur me enët e gjakut dhe shërben si embrion e organit të frymëmarrjes. Nga brenda, zgavrën allantomike është ngjitur me të, e cila është organi i izolimit dhe mbron embrionin nga tharja dhe lëndimet. Zgavra allantomike rrethon embrionin në zgavrën e amnionit, e cila është e mbushur me një lëng me vaj. Nëpërmjet litarit të zymtë, embrioni është i lidhur me qesen e verdhëse - burimi kryesor i ushqyesve.
Për kultivimin e suksesshëm të viruseve në trupin e zhvillimit të embrioneve të pulave, kërkohet një temperaturë e caktuar (36 0 -38 0), lagështia (50-70%), si dhe ventilim i mjaftueshëm. Ata infektojnë embrionet e pulave të moshës së caktuar të inkubuar nga 6 deri në 13 ditë në varësi të llojit të viruseve dhe metodës së infeksionit. Është e nevojshme për t'u përgatitur: Qëndroni për vezë, flluska me alkool dhe jod, tub provë me parafine sterile, dritaret e veshjes, çanta të leshta sterile dhe garzë, të mbështjellë në enët sterile të letrës, shiringa sterile, hala, piskatore, hala varëse. Mjetet vendosen në një filxhan me alkool, ku ata janë gjatë gjithë punës, para çdo manipulimi, ata janë sterilizuar gjithashtu duke djegur në flakën e ndezësit. Duart para punës të larë tërësisht, rekomandohet të vishni një maskë nga Marley.
Për punë, embrionet e qëndrueshme janë zgjedhur, të tejdukshëm vezët e inkubuar në ovoskop. Një embrion e qëndrueshme është e luajtshme, enët e gjakut të guaskës janë të mbushura me gjak. Vezët e zgjedhura janë të dezinfektuara me kujdes në fund të hapur (ose në anën e vezës): Shell po fshin me alkool, lubrifikuar me jod, ri-trajtohet me alkool dhe djeg.
1.3.2. Infeksioni i embrionit të pulave në shell Chorionallant
Për infeksion, përdoren embrionet e pule 8-12 ditë. Fazat kryesore të infeksionit:
1. Veza është vendosur në qëndrim në një pozicion vertikal në mënyrë që qese e ajrit të jetë në krye, të shpenzojë sterilizimin e guaskës në fund të hapur të vezës.
2. Mbi qendren e airbag bën shpimet e guaskës duke përdorur gjilpërën e përgatitjes.
3. Në vrimën që rezulton, gërshërët injektohen me një degë dhe prerë dritaren në shell prej rreth 1.5 cm në diametër.
4. Nëpërmjet vrimës, me kujdes mbulon gjilpërën e fletës së brendshme të shell shell dhe zhvishem në një pjesë të vogël (0.5-1 cm 2).
5. Shelli chorionallant është i infektuar me 0.1-0.2 ml të një materiali që përmban virus me një pipetë parser ose një shiringë.
6. Dritarja në predhë është e mbyllur me një film të veçantë elastik ose qelqi steril të veshjes dhe bashkangjitur parafini i shkrirë.
Embrionet e infektuara vendosen në një termostat në një pozicion vertikal dhe inkubohen për 2-3 ditë, pas së cilës një autopsi është bërë sipas rregullave të mëposhtme:
1. Veza vendoset në qëndrim në mënyrë që hapësira ajrore të jetë në krye, vendi i hapjes është sterilizuar.
2. Gërshërë sterile janë prerë nga guaska përgjatë kufirit të hapësirës ajrore.
3. Përdorimi i piskatoreve, hiqni shell në kufi. Shelli lakurik lakuriq është prerë përgjatë buzës së guaskës. Nëpërmjet vrimës që rezulton, të gjitha përmbajtjet e vezës në një filxhan ose tabaka janë derdhur.
4. Shell chorionallant që mbetet brenda shell është hequr me kujdes nga piskatore dhe vendoset në një filxhan steril me kripur. Këtu është pikturuar dhe mëson të ndryshojë, duke vendosur një filxhan në një sfond të errët.
Për të marrë një material që përmban një virus nga shell Chorionallant, është e nevojshme për të blu atë me gërshërë dhe pastaj të bluaj në një llaç me qelqi kuarc, duke shtuar një zgjidhje të kripur. Pezullimi që rezulton është centrifuguar në 2000 rpm për 10-15 minuta dhe supernatanti është përdorur si një material që përmban virus.
Fik. 3. Infeksioni i embrioneve të pulave
1.3.3. Infeksioni i kavitetit Allanto
Për infeksionin merrni embrionet e 10-11 ditëve të moshës. Fazat kryesore të infeksionit:
1. Veza është vendosur në qëndrim me një fund të hapur dhe të shpenzojë sterilizimin e guaskës mbi hapësirën ajrore.
2. Në qendër të fund të trashë bëjnë një shpim të guaskës duke përdorur gjilpërën përgatitje.
3. Vrima është futur në gjilpërë të një shiringë që përmban mbarështimin e virusit. Gjilpërë promovohet në një drejtim vertikal me 2-3 mm nën nivelin e qeseve të ajrit dhe pastaj administrohet 0.1-0.2 ml material.
4. Vrima në guaskë është e vulosur me parafine sterile të shkrirë.
Embrionet e infektuara qëndrojnë në një termostat zakonisht brenda 2 ditëve. Para hapjes së vezëve vendosen natën në frigorifer në 4 0 C. Një hapje kryhet në rendin e mëposhtëm:
1. Veza është instaluar në qëndrim në mënyrë që qese e ajrit të jetë në krye, ata janë sterilizuar mbi të.
2. Përdorimi i gërshërëve, predha prerë pak mbi kufirin e hapësirës ajrore.
3. Hiqni me kujdes shell shell me piskatore, pas së cilës shell Chorionallant është shpuar me një pipetë parser në vendin ku nuk ka anije, dhe lëngu allantomik është i ngopur.
4. Lëngu allantomik transferohet në një tub të testit steril, dhe pjesa është mbjellë në supë për të kontrolluar sterilitetin bakteriologjik.
