Большое значение в развитии вирусологии имело введение методов культивирования вирусов в куриных эмбрионах. Для репродукции вируса используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста, инкубированные в термостате при 37 С. Необходимым условием для правильного развития зародыша является соблюдение определенной влажности воздуха, которую можно создать, поместив в термостат сосуд с водой. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах эмбриона, который заражают:
1) на хорион-аллантоисную оболочку;
2) в аллантоисную полость;
3) в амниотическую полость;
4) в желточный мешок.
Заражение куриных эмбрионов проводят в боксе с использованием стерильных инструментов. Перед: заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом.
Заражение на хорион-аллантоисную оболочку . После дезинфекции яйца осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого концы, снимают подскорлупную оболочку - при этом обнаруживается хорион-аллатиоисная оболочка. Инфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или пастеровской пипетки наносят па хорион-аллантоисную оболочку. После заражения отверсто закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом заливают парафином. На другой стороне яйца простым карандашом пишут название инфекционного материала и дату заражения.
Заражение в амниотическую полость. Яйцо овоскопируют и на боковой стороне выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов. Этот участок отмечают карандашом. Яйца укладывают на подставку в горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем прокалывают отверстие и скорлупе на глубину 2-3 мм, через которое вводят на это же расстояние иглу с инфекционным материалом непосредственно в амниотическую полость. Для того чтобы вводимая жидкость не вытекала обратно, предварительно делают прокол над воздушным мешком. После чего оба отверстия заливают парафином.
Заражение в аллантоисную полость. Заражение производят и затененном боксе. Отмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. Если игла попала в аллантоисную полость, то наблюдается смещение тени эмбриона. После заражения отверстие заливают парафином.
Заражение, в желточный мешок. Скорлупу дезинфицируют. Яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный меток был обращен вверх. Над воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. Через отверстие в скорлупе в скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм вводят иглу шприца, которая попадает в желточный мешок. Материал вводят в объёме 0,2-0,3 мл. После введения материала отверстие парафинируют.
Температурный режим и длительность инкубации зависят от биологических свойств данного вируса. Инфицированные яйца ежедневно проверяют, овоскопируют для проверки жизнеспособности эмбриона. Если эмбрионы погибают в первые сутки, то причиной этого обычно бывает травма при заражении. Такие яйца выводят из опыта. Наличие вируса в заражённом эмбрионе определяют по характерным изменениям хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного эмбриона. Вирусы, не обладающие гемагпотинирующей активностью, выявляют с помощью РСК. Для выявления вируса в аллантоисной или амниотической жидкостях зараженных эмбрионов ставят РГА.
Большинство известных вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе (рис.4). Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, оспо вакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса . Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.
Строение куриного эмбриона и способы его заражения: 1 - в амнион ; 2 - в аллантоисную полость; 3 - в желточный мешок. (Микробиология и иммунология. Под редакцией Воробьева А.А. - М. - 1999).
Самая наружная внезародышевая оболочка, примыкающая к скорлупе или материнским тканям и поэтому служащая местом обмена между зародышем и окружающей его средой, называется Хорионом. У видов, откладывающих яйца, основная функция хориона — осуществление дыхательного газообмена. У млекопитающих хорион участвует в дыхании и питании, выделении, фильтрации и синтезе веществ. У примитивных организмов хорион - вторичная оболочка, а у продвинутых - оболочка плода. Полость между хорионом и амнионом - хорионамниотическая.
Амнион (греч. Amnion), Амниотический мешок или Водная оболочка — одна из зародышевых оболочек у эмбрионов пресмыкающихся, птиц, млекопитающих.
Эволюционно амнион возник для защиты эмбрионов от высыхания при развитии вне водной среды. Поэтому позвоночных животных, откладывающих яйца (рептилии и птицы), а также произошедших от рептилий млекопитающих относят к группе амниот («Животные с яйцевыми оболочками»). Предшествующие классы и надклассы позвоночных (головохордовые, круглоротые, рыбы, земноводные) откладывают икру в водную среду, поэтому им не требуется водная оболочка. Эти классы животных объединяют в группу анамний. В отличие от анамний амниотам не требуется водная среда для размножения и раннего развития, поэтому амниоты не привязаны к водоемам. В этом состоит эволюционная роль амниона.
При родах млекопитающих водная оболочка лопается, воды вытекают, а остатки амниона на теле новорождённого часто называют «рубашечкой», которая повсеместно с давних времён является знаком удачи и прочих суеверий (отсюда, в частности, русская поговорка про тех, кто «в рубахе родился»).
Аллантоис (от греч. allantoeid?s — колбасовидный) — эмбриональный орган дыхания высших позвоночных животных; зародышевая оболочка, развивающаяся из задней кишки эмбриона. Кроме того, аллантоис участвует в газообмене зародыша с окружающей средой и выделении жидких отходов. Аллантоис, вкупе с другими эмбриональными оболочками — амнионом и хорионом, является определящим признаком высших позвоночных животных — млекопитающих, птиц и рептилий.
У яйцекладущих птиц и рептилий аллантоис развивается вокруг эмбриона вдоль стенок скорлупы. В своём внешнем слое, называемым мезодермой , он создаёт разветвлённую сеть кровеносных сосудов, с помощью которых происходит взаимодействие с внешней средой. У млекопитающих аллантоис входит в состав пуповины.
Существует несколько способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок, тело эмбриона.
Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка.
На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05 - 0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).
Заражение в аллантоисную полость . Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.
Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5 - 10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.
Куриный эмбрион, инфицированный вирусным материалом, ставят в инкубатор на 2-3 дня, в зависимости от характера внесенного вируса. Для развития вирусов из проб, взятых у больного (например, смывов из носоглотки, использующихся при диагностировании гриппа), куриный эмбрион представляет хорошую среду. По типу изменений, скажем в тканях хорионаллантоисной оболочки, можно непосредственно определить, с каким вирусом мы имеем дело. Очень характерные изменения дают вирусы оспы и герпеса. Некоторые вирусы очень интенсивно размножаются в различных тканях куриного эмбриона и дают исходный материал для приготовления вирусных антигенов, необходимых при лабораторной диагностике вирусных заболеваний. Вирусы, размноженные в курином эмбрионе, были использованы как исходный материал для получения восемнадцати видов прививочных вакцин.
Несмотря на положительные стороны культур клеток, получивших столь широкое распространение в современных вирусологических лабораториях, куриный эмбрион во многих случаях сохранил свое первенствующее значение и по-прежнему служит классическим материалом для работы. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке, а также в РГА.
Цель занятия: ознакомить студентов с методами заражения куриных эмбрионов для культивирования вирусов.
Оборудование и материалы: куриные эмбрионы 9-12 дневного возраста инкубации, овоскоп, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пинцеты, ножницы, лейкопластырь, иглы, шприцы, простые карандаши, пробойники, иголочки, таблицы, схемы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.
Существенно влияет на размножение вирусов в эмбрионах метод заражения. Перед заражением инкубированные яйца про-свечивают, погибшие отделяют. На скорлупе яиц с живыми эмбрионами, кото-рые различают по красному цвету кровеносных сосудов и движению эмбриона, карандашом отмечают место заражения.
Заражают эмбрионы в стерильном боксе, имеющем рабочий стол, два табуре-та, подводку газа, водопровод и вакуум. Заражение в амниотическую полость проводят в затемненной комнате. Рабочее место должно быть хорошо освещено. Перед работой стол дезинфицируют. Для дезинфекции поверхности яиц под-готавливают антисептический раствор (70%-ный спирт, 2%-ный раствор йода) и обернутую ватой деревянную палочку, согнутый зубной зонд или бормашину для просверливания яичной скорлупы. Яйца заражают при помощи стерильных шприца для туберкулинизации и специальных игл. Место заражения на яйце заливают парафином. Для этого готовят парафиновые палочки: в пробирку, за-полненную расплавленным парафином, вводят стеклянную палочку, следя за тем, чтобы она находилась в центре пробирки до остывания парафина.
Когда парафиновая палочка понадобится, стенки пробирки нагревают на го-релке и за стеклянную палочку вытягивают парафин из пробирки. Подержав палочку над пламенем, расплавляют необходимое для закрытия отверстия в яйце количество парафина. Этот способ очень чист, и при нем не образуются пары парафина.
Кроме того, на рабочем столе в боксе размещают стакан со стерильными ватными тампонами, стакан с 3 % раствором едкого натра для использо-ванных инструментов и сосуд с раствором хлорамина для использованных стек-лянных предметов. В случае надобности можно приготовить подставку для яиц, небольшую эмалированную чашку и стерильные питательные среды. Подготов-ленный таким образом рабочий стол в течение 1-2 ч подвергают УФ-облучению .
Учитывая патогенность исследуемых вирусов, работы ведут в маске, резино-вых перчатках и защитных очках.
Существует шесть методов заражения эмбрионов. Наиболее часто используют заражение в аллантоисную полость и на хорионаллантоисную оболочку, реже - в амниотическую полость и в желточный мешочек и совсем редко - в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО. Выбор метода определяется тропизмом вируса, а также целью заражения. При любом методе заражения вводят 0,1-0,2 мл инфекционного материала.
При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и др. Существует несколько вариантов метода.
Первый вариант. Эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша, а иногда с противоположной зародышу стороны на 5-6 мм выше границы воздушной камеры делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм (рис. 16). После инъекции вируссодержащего материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стерильного парафина.
Рисунок 16. Заражение в аллантоисную полость (первый вариант) (по Николау)
Второй вариант. Сделанное в скорлупе над воздушной камерой отверстие используют лишь для выхода части воздуха. Отверстие же для самого заражения делают на участке бессосудистой зоны хорионаллантоисной оболочки (ХАО) со стороны зародыша. Иглу вводят на глубину не более 2-3 мм. Инъецируют инфицирующую жидкость в объеме 0,1-0,2 мл и закрывают отверстие парафином (см. рис. 17).
Этот метод заражения куриных эмбрионов чаще используют для культивирования эпителиотропных и пантропных вирусов оспы, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных , болезни Ауески , катаральной лихорадки овец и др.
Такое заражение может быть выполнено через естественную или искусственную воздушную камеру.
Для заражения через естественную воздушную камеру эмбрион помещают в штатив вертикально тупым концом вверх и в скорлупе против центра воздушной камеры вырезают круглое окно диаметром 15-20 мм. Через это окно пинцетом снимают подскорлупную оболочку. На обнажившийся участок ХАО наносят 0,2 мм вируссодержащей суспензии (рис. 18), отверстие закрывают лейкопластырем или реже покровным стеклом, укрепив его расплавленным парафином.
Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого, так как оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО и, следовательно, ведет к образованию большего количества вируса.
Рисунок 17. Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (второй вариант) (по Николау)
Рисунок 18. Заражение на ХАО через естественную воздушную камеру (по Николау и др.)
Рисунок 19. Заражение куриного эмбриона на ХАО через искусственную воздушную камеру (по Николау и др.)
Для заражения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2-0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Сложность метода в том, что, делая второе отверстие, необходимо осторожно снять вначале кусочек скорлупы, затем скользящим движением, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 19, а).В результате через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО (рис. 19, б).
Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекционную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отверстие нет необходимости, так как внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нарушается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры окружающей среды.
Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.
Большей частью им пользуются для размножения хламидий, а также вирусов болезни Марека , ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают эмбрионы 5-7-дневного, а иногда и 2-3-дневного возраста (вирус лихорадки долины РИФ). Используют два варианта заражения.
Первый вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45° к вертикальной оси в направлении, противоположном месту нахождения зародыша (рис. 20).
Рисунок 20. Заражение куриного эмбриона в желточный мешок (по Николау и др.)
Второй вариант. Иногда аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрионе; при этом зародыш находится внизу, а желток над ним. Отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного парафина.
Для этой цели используют эмбрионы 6 - 10-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Есть два способа заражения.
Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помещают на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения.
Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5-2,5 см. Через него пинцетом под контролем глаза снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, продавливая хорионаллантоисную оболочку по направлению к зародышу. Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амниона, вводят вируссодержащий материал (рис. 21). Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инкубируют в вертикальном положении.
Рисунок 21. Заражение куриного эмбриона в амнион открытым способом (по Николау и др.)
При овоскопировании 11- 13-дневных эмбрионов отмечают крупный кровеносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы, наносят 1-2 капли спирта, что делает на некоторое время подскорлупную оболочку прозрачной. Под контролем глаза на овоскопе иглу вводят в сосуд, что подтверждается его подвижностью при небольших боковых движениях иглы. Обнаженный участок подскорлупной оболочки закрывают кусочком лейкопластыря.
Можно материал в сосуды ввести и несколько отличающимся способом: срезают скорлупу над воздушной камерой, подскорлупную оболочку смачивают спиртом и в ставшие видными сосуды ХАО вводят материал. Отверстие закрывают кусочком стерильного лейкопластыря.
Описанные технические приемы экспериментального заражения куриных эмбрионов не единственные, а имеют различные варианты.
Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Известно два варианта метода.
Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.
Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело зародыша. Материал вводят в головной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.
Перед дальнейшей инкубацией на скорлупе зараженных любым методом куриных эмбрионов простым (графитным) карандашом пишут, чем заражен эмбрион и когда, а если нужно, то и другие сведения. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации, в процессе которой происходят репродукция внесенных вирусов и их накопление в соответствующих структурах. Температура инкубации эмбрионов варьирует от 33 до 38 °С в зависимости от свойств вируса, которым проведено заражение. За эмбрионами ведут постоянное наблюдение, просматривают на овоскопе, отбирая павшие.
Гибель эмбрионов в первые 24 ч после заражения чаще всего обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, или травмированием при заражении. Эта гибель считается неспецифической. В более поздние сроки эмбрионы гибнут в результате, как правило, размножения в эмбрионах вируса. Обнаружив погибшие эмбрионы, их сразу же переносят в холодильник с температурой 4 °С. Такие условия, с одной стороны, способствуют сохранению активности накопившегося в эмбрионе вируса, с другой - уплотнению тканей и запустению сосудов, что значительно облегчает последующее вскрытие.
Эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления вируса. Для каждого вируса и даже штамма этот срок является определенным и варьирует в пределах от 2 до 7-8 сут. Так, для вируса ньюкаслской болезни штамма Н он составляет 2-3 дня, для того же вируса штамма В,- 5 дней, для вируса инфекционного ларинготрахеита птиц - 5 дней и т. д. Затем все эмбрионы умерщвляют охлаждением при 4 °С в течение не менее 3-4 ч и вскрывают.
Воснове метода лежит удаление эмбриона из яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает хорионаллантоисная оболочка. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, то образует-ся своеобразная культура ткани, в которой может размножаться вирус. Метод обладает рядом преимуществ: он позволяет получить более чистый вирус, чем в аллантоисно-амниотической жидкости, что важно для снижения аллергизирующих свойств вакцин, приготовленных из этого материала; отсутствие желточного мешка и, следовательно, содержащихся в нем специфических антител позволяет лучше размножаться некоторым вирусам. В некоторых случаях этот метод дает хорошие результаты в диагностических работах, так как при нем можно вводить большие количества исследуемого материала, что увеличивает возможность вы-деления вируса.
Метод предложил Бернкопф еще в 1949 г., но из-за трудностей применения широко не используется. Трудности эти связаны со свойством хорионаллантоисной оболочки в процессе инкубации отделяться от скорлупы, что снижает ценность культуры и затрудняет манипуляции получения вируса и замены пита-тельной среды.
Е. Гройель (1963) ввел ряд модификаций, которые позволили устранить эти трудности. Он предложил использовать 15-дневные и даже более старые яйца, которые в процессе инкубации следует часто переворачивать для равномерного развития оболочки на скорлупе яйца. При просвечивании обозначают границы воздушной камеры. Скорлупу отпиливают на 0,5 см выше этой линии, на край скорлупной оболочки наливают расплавленный парафин (56-58 С°), который застывая, фиксирует край яйца. Затем вырезают круглое отверстие в оболочке над зародышем, оставляя вокруг узкий ободок. Следующий этап - осторожное удаление зародыша из яйца. При этом яйцо следует удерживать в горизонталь-ном положении и медленно поворачивать. Таким путем находят сосуды, связы-вающие эмбрион с ХАО, и перерезают их ножницами. Если яйцо держать верти-кально, то зародыш своей массой оттягивает оболочку, отрывая ее обычно в области острого конца яйца. Попадание даже небольшого количества жидкости между ХАО и скорлупой вызывает полную отслойку оболочки в течение 1-2 дней.
После удаления зародыша оболочку, выстилающую яйцо, несколько раз про-мывают физиологическим раствором, охлажденным до 4-0°С, до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной. Затем в полость яйца вводят 20 мл питательной среды, подогретой до 37 °С, и яйцо закрывают стерильным резиновым колпач-ком, предварительно погрузив его в парафин. Трубка с резиновой пробкой, вмонтированная в яйцо, обеспечивает как взятие, так и введение жидкости без опасности бактериального заражения. Такой биологический объект сохраняет жизнеспособность в течение нескольких дней.
По методике Йошино и других, полость деэмбринированных яиц заполняют раствором агара в растворе Хенкса. Заражают деэмбринированные яйца через трубку в колпачке.
Контрольные вопросы:
1. Строение куриного эмбриона.
2. Для чего используют куриные эмбрионы в вирусологии?
3. Каково строение развивающегося куриного эмбриона?
Эмбрионы используют в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения. Размножение в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша.Способы заражения: на хорионаллантоисную оболочку, в аллотоисную и амниотическую, желточный мешок, тело эмбриона.
В зависимости от техники приготовления 3 вида клеток:
Однослойные способны размножаться на поверхности химически нейтрального стекла в виде монослоя;
Суспензионные, размн-я во всем объеме питательной среды;
Органные-цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру.
Приготовление первичной культуры клеток складываются из нескольких этапов: измельчение ткани, разъединение клеток, отмывание полученной суспензии от трипсина.
Индикация:
- цитопатичекое действие- видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до отторжения от стекла.
Вирусные включения- это скопление вирусных частиц или отделение компонентов вирусов в цитоплазме или ядре клеток.
Бляшки-ограниченные участки, состоящие из дегенеративных клеток. Они видны как светлые пятна на фоне окрашенных клеток.
Цветная проба
Гемадсорбция-способность культур клеток адсорбировать на своей поверхности эритроциты.
Интерференция.
Бактериофаги- вирусы бактерий, обладающие способностью проникать в бактериальные клетки, вызывать их растворение. Имеют форму головастика, некоторые кубической нитевидной формы. Состоят из икосаэдрической головки и хвостого отростка. Внутри хвостого отростка цилиндрический стержень,снаружи- чехол, отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с короткими шипами. Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белка. У фагов имеющих форму сперматозойда, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали внутри головки. Белки входят в состав оболочки. Кроме структурных белков обнаружены внутренние белки, связанные с нуклеиновой кислотой и белки-ферменты, участвующие во взаимодействии фага с клеткой.
Вирулентные фаги могут только увеличиваться в количестве посредством литического цикла. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: адсорбции бактериофага на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки, выхода бактериофагов из клетки.
Первоначально бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остается снаружи. Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние иРНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс - созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц.
Читайте также:
|
Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут в большей или меньшей степени размножаться в курином эмбрионе. Наличие плотной скорлупы защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды.
Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также для изготовления вирусных вакцин и диагностических препаратов. Но этот метод имеет недостатки: 1) невозможно наблюдать в динамике за патологическими изменениями, происходящими в эмбрионе после заражения его вирусом; 2) при вскрытии эмбриона, зараженного вирусом, часто не обнаруживается видимых изменений и приходится выявлять наличие вируса в тканях, в жидкостях эмбриона, пользуясь другими вирусологическими методами (например, реакцией гемагглютинации); 3) метод культивирования в куриных эмбрионах пригоден не для всех вирусов. Несмотря на имеющиеся недостатки метод сравнительно прост, удобен и дешев и широко используется в вирусологических исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе с ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами.
1.3.1. Строение куриного эмбриона
Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой – скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, которая является органом выделения и защищает зародыш от высыхания и травм. Аллантоисная полость окружает зародыш, находящийся в полости амниона, которая наполнена околоплодной жидкостью. Через желточный канатик зародыш соединён с желточным мешком – основным источником питательных веществ.
Для успешного культивирования вирусов в организме развивающихся куриных эмбрионов требуется определённый температурный режим (36 0 -38 0), влажность (50-70%), а также достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определённого возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Необходимо подготовить: подставку для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирку со стерильным парафином, покровные стёкла, пакетики стерильной ваты и марли, завёрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иглы, пинцеты, препаровальные иглы. Инструменты помещают в стаканчик со спиртом, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипуляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Руки перед работой тщательно моют, рекомендуется надеть маску из марли.
Для работы отбирают жизнеспособные эмбрионы, просвечивая инкубированные яйца в овоскопе. Жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кровью. Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце (или на боковой стороне яйца): скорлупу протирают спиртом, смазывают йодом, повторно обрабатывают спиртом и обжигают.
1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку
Для заражения используют куриные эмбрионы 10-12-дневного возраста. Основные этапы заражения:
1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху, проводят стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.
2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.
3. в образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и вырезают окно в скорлупе около 1,5 см в диаметре.
4. Через отверстие осторожно надрывают иглой внутренний листок скорлупной оболочки и отслаивают на небольшом участке (0,5-1 см 2).
5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки путём нанесения на неё 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала с помощью пастеровской пипетки или шприца.
6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной плёнкой или стерильным покровным стеклом и прикрепляют расплавленным парафином.
Заражённые эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:
1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное пространство было наверху, проводится стерилизация места вскрытия.
2. Стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного пространства.
3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку по границе. Обнажённую хорионаллантоисную оболочку подрезают вдоль края скорлупы. Через образовавшееся отверстие выливают всё содержимое яйца в чашку или лоток.
4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь её расправляют и изучают изменения, поместив чашку на тёмный фон.
Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, её нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочная жидкость используется в качестве вируссодержащего материала.
Рис. 3. Заражение куриных эмбрионов
1.3.3. Заражение в аллантоиную полость
Для заражения берут эмбрионы 10-11-дневного возраста. Основные этапы заражения:
1. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.
2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.
3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение вируса. Иглу продвигают в вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного мешка и затем вводят 0,1-0,2 мл материала.
4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью расплавленного стерильного парафина.
Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4 0 С. Вскрытие производится в следующем порядке:
1. Яйцо устанавливается на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют.
2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше границы воздушного пространства.
3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупную оболочку, после чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную жидкость.
4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на бактериологическую стерильность.
