Okužba horioalantoične membrane. Ta metoda je ena najpogosteje uporabljenih. Njegova glavna prednost je, da številni virusi, ko se razmnožujejo na horioalantoični membrani, povzročijo njene značilne spremembe in tvorijo lezije v obliki belkastih lis-plakov različnih morfologij.
Za okužbo se uporabljajo zarodki, stari 10-12 dni. Značilno je, da horioalantoisno membrano predremo tako, da naredimo luknjo v lupini nad zračnim mešičkom ali na strani jajčeca.
Glavne stopnje okužbe horioalantoične membrane iz zračnega prostora:
1. Jajce postavimo na stojalo v navpični položaj
tako da je zračna blazina na vrhu)"; izvedite
temeljita sterilizacija lupine na topem koncu jajca.
2. Lupina je preluknjana nad sredino zračne mešičke.
z uporabo disekcijske igle.
3. Čeljust škarij se vstavi v nastalo luknjo in
izrežite okence v lupini premera približno 1,5 cm. (Kje
Ne dovolite, da koščki lupine pridejo v jajce).
4. Skozi narejeno luknjo se vidi notranji list
lupinasto membrano, jo previdno raztrgamo z očesom
pinceto ali iglo in odlepite na majhnem območju (0,5-1
cm 2), pri čemer se razkrije horioalantoična membrana.
5. Okuži horioalantoično membrano
z nanosom 0,1-0,2 ml materiala, ki vsebuje virus
(na primer virus vakcinije) s Pasteurjevo pipeto
ali brizgo.
6. Okence v školjki je zaprto s posebno elastiko
film, sterilno pokrovno stekelce ali steklo
kapa Za pritrditev stekla in pokrova na školjko
uporabite staljeni parafin.
Okužene zarodke postavimo v termostat v navpičnem položaju in inkubiramo 2-3 dni, nato pa opravimo obdukcijo po naslednjih pravilih:
1. Jajce je postavljeno na stojalo, tako da je zrak
prostor je bil na vrhu, prostor se sterilizira
prihajajoče odprtje z ustrezno obdelavo
alkohol in jod.
2. Po odstranitvi filma, pokrovnega stekelca ali pokrovčka,
S sterilnimi škarjami odrežite lupino vzdolž meje zraka
prostora.
3. S pinceto odstranite lupino.
Izpostavljena horioalantoična membrana (ki lahko
vidne spremembe) so obrobljene ob robu lupine. Skozi
luknjo, ki je nastala, vlijemo celotno vsebino jajca v skodelico
ali pladenj.
4. Preostalo horioalantoično tkivo znotraj lupine
lupino previdno odstranimo s pinceto položimo v
sterilno skodelico s fiziološko raztopino. Tukaj je
poravnajte in preučite spremembe tako, da skodelico postavite na temno
ozadje.
Da bi dobili material, ki vsebuje virus iz horioalantoične membrane, ga je treba zdrobiti s škarjami in nato zmleti v možnarju s kremenčevim steklom ter dodati fiziološka raztopina. Nastalo suspenzijo centrifugiramo pri 2000 obratih na minuto 10-15 minut in uporabimo supernatant! kot material, ki vsebuje virus (potrebno je obvezno testiranje za odsotnost bakterijske kontaminacije).
Okužba v alantoični votlini. Ta metoda
Odlikuje ga preprostost in je dragocen, ker prispeva k znatnemu kopičenju virusa. Za okužbo se običajno vzamejo zarodki, stari 10 dni. Glavne stopnje okužbe v alantoični votlini:
}. Jajce se postavi na stojalo s topim koncem navzgor in lupina se sterilizira nad zračnim prostorom.
2. V središču topega konca se v lupini naredi luknja z
z uporabo disekcijske igle.
3. Igla brizge z raztopino se vstavi v luknjo
virus (kot je virus gripe). Igla je napredovala v
navpični smeri 2-3 mm pod nivojem zraka
vrečko in nato injicirajte OD-0,2 ml materiala.
4. Luknja v lupini je zatesnjena z uporabo
stopljeni sterilni parafin.
Okužene zarodke hranimo v termostatu običajno 2 dni. Pred odprtjem jajca čez noč postavimo v hladilnik pri 4°. Odpiranje se izvede v naslednjem vrstnem redu:
1. Jajce postavimo na stojalo tako, da je zračna blazina na vrhu, lupina nad njo je sterilizirana;
2. S škarjami zarežemo lupino nekoliko višje
meje zračnega prostora.
3. Nato s pinceto previdno odstranite lupino lupine
zakaj se horioalantoisna membrana preluknja s Pasteurjem
pipetirajte na mesto, kjer ni žil, in posesajte alantois
tekočina (lahko zberete 5-6 ml).
4. Alantoisna tekočina se prenese v sterilno
epruveto, del pa se nacepi v juho, da se preveri
bakteriološka sterilnost.
Metoda okužbe z alantoično votlino se pogosto uporablja za gojenje virusa influence, pa tudi mumpsa in vakcinije.
Okužba v amnijski votlini
Ta metoda je težja za izvedbo in se uporablja nekoliko manj pogosto kot prejšnje. Njegova posebnost je, da se slednji ob okužbi z nekaterimi pnevmotropnimi virusi (na primer virusi gripe, mumpsa) razmnožujejo ne le v celicah amnijske membrane, temveč tudi v dihalnem traktu in pljučnem tkivu zarodka, kjer okužena tekočina prodira. Za okužbo se uporabljajo zarodki, stari 7-12 dni. Okužba v amnijsko votlino se izvaja z odprto metodo, ko se razmeroma malo naredi za vnos materiala v lupino. velika luknja, ali z zaprto metodo, ko se okužba izvede s punkcijo lupine.
Prvi od njih je bolj travmatičen, drugi je manj zanesljiv, saj z delovanjem na slepo ni vedno mogoče vstaviti igle v amnijsko votlino.
Odprta tehnika okužbe:
1. Jajce postavimo na stojalo in steriliziramo
lupina v območju topega konca.
2. Nad središčem zračnega prostora v lupini
S škarjami izrežite okence premera 2 cm (kot
za okužbo na horioalantoični membrani).
3. Previdno odstranite notranji list lupine
membrano s pinceto, s čimer izpostavite podlago
horioalantoična membrana.
S škarjami izrežite majhno luknjo
horioalantoične membrane na mestu, kjer ni krvne žile, in v rez vstavite pinceto za oči. Amnijsko membrano primemo s pinceto in plodovnico izvlečemo preko površine horioalantoične membrane.
5. Držite amnijsko membrano v tem položaju,
okužite amnijsko votlino z injiciranjem 0,1-
0,2 ml razredčitve virusa.
6. Luknjo v lupini zapremo s sterilnim pokrovčkom
ali pokrovno steklo, z uporabo za njihovo pritrditev in
zapiranje jajca s staljenim parafinom.
Okužene zarodke inkubiramo 2 dni, odmrle pa prvi dan zavržemo (opazujemo skozi okence v lupini). Po odprtju zarodke hranimo čez noč v hladilniku pri 4°C.
Tehnika odpiranja zarodka med okužbo v amnijski votlini:
1. Po sterilizaciji mesta prihajajoče obdukcije ga odrežite
lupina nekoliko nad robom zračnega mešička.
2. Horioalantoična membrana je punktirana
pasterjevo pipeto in odstranite alantoično tekočino.
3. Zgrabite amnijsko vrečko s pinceto, prebodite
njeno membrano z iglo brizge ali Pasteurjevo pipeto in
vpije se amnestična tekočina (od 0,5 do 1,5 ml). U
okuženega zarodka, mora biti tekočina medtem motna
kot normalen zarodek je prozoren.
4. Odvzeto tekočino prenesemo v sterilno epruveto, 0,1-
0,3 ml ga nacepimo v juho za bakteriološko kontrolo
sterilnost.
Izolacija virusov pri laboratorijskih živalih.
Izbira laboratorijskih živali je odvisna od vrste virusa. Laboratorijske živali so biološki model. Včasih je potrebno izvesti 3-5 "slepih", asimptomatskih prehodov, preden je mogoče virus prilagoditi laboratorijske razmere. Vendar pa laboratorijske živali niso občutljive na nekatere viruse, v tem primeru je treba uporabiti naravno dovzetne živali. Kot na primer pri prašičji kugi in kužni anemiji konj.
Namen okužbe laboratorijskih živali:
1. Preučiti patogenezo bolezni;
2. Izolirati virus iz patogenega materiala;
3. Izdelava imunskih in hiperimunskih serumov;
4. Proizvodnja cepiv;
5. Vzdrževanje virusov v laboratorijskih pogojih;
6. Titracija, da se določi količina virusa na prostorninsko enoto;
7. Biološki model za postavitev nevtralizacijske reakcije;
Izbira metode za okužbo laboratorijskih živali je odvisna od tropizma virusa. Tako se pri gojenju nevrotropnih virusov živali okužijo v možgane; dihalni intranazalno, intratrahealno; dermatropno - subkutano in intradermalno.
Okužba se izvaja v skladu s pravili asepse in antiseptikov.
Obstaja veliko načinov za vnos materiala, ki vsebuje virus, v telo živali:
Subkutano; - Intracerebralno; - intradermalno;
Intraperitonealno; - Intramuskularno; - intraokularno;
Intravenozno; - Intranazalno; - Prehranska;
Po okužbi živali označimo, damo v izoliran boks in spremljamo 10 dni. Pogin živali prvi dan po okužbi velja za nespecifičen in se kasneje ne upošteva.
3 znaki kažejo na učinkovitost okužbe:
Prisotnost kliničnih znakov
Smrt živali
Patoanatomske spremembe (velikost, oblika, barva in konsistenca organa).
Piščančji zarodek je oplojeno kokošje jajce, v katerem se razvije zarodek (embrio). Gojenje virusov na piščančjih in prepeličjih zarodkih je v zadnjem času postalo zelo razširjeno kot ena najpreprostejših in najbolj zanesljivih metod za gojenje in diagnosticiranje številnih virusov in nekaterih bakterij - Brucella, Rickettsia, Vibrio.
Številne človeške in živalske viruse je mogoče gojiti v razvijajočih se piščančjih zarodkih. Embrionalno tkivo, zlasti membrane zarodka, bogate z zarodnim epitelnim tkivom, je ugodno okolje za razmnoževanje številnih virusov. Na horioalantoični membrani se uspešno razvijajo virusi z epiteliotropnimi lastnostmi (črne koze, ILT itd.), ki povzročajo makroskopsko vidne spremembe. Različni predstavniki miksovirusov (gripa, atipična kokošja kuga, pasja kuga itd.), virusi infekcioznega bronhitisa, račji hepatitis, arbovirusi itd. se dobro razmnožujejo v zarodku, ko se material vnese v alantoisno votlino. Nekatere viruse je mogoče uspešno gojiti v rumenjakovi vrečki.
Prednosti:
1. Ekonomsko donosna, poleg tega so jajca lahko dostopna;
2. Razvijajoči se piščančji zarodki nimajo zaščitnih mehanizmov, ker imunski sistem še ni razvit;
3. Jajčne lupine preprečujejo prodiranje bakterij in virusov iz okolja skozenj;
Za gojenje in izolacijo virusov na piščančjih zarodkih je potrebna zelo preprosta oprema - navaden termostat ali inkubator.
Pogoji:
1. Jajca so pridobljena s kmetij, za katere je znano, da so varna nalezljive bolezni;
2. Bolje je pridobiti piščančje zarodke iz belih pasem piščancev (Leghorn, Russian White), ker so bolj odporni na manipulacije in ne poginejo zaradi manjših poškodb. Poleg tega je njihova lupina bela in bolj prozorna kot pri drugih pasmah in je lažje vidna skozenj, kar je priročno za ogled in opazovanje med delom z njimi;
3. Za inkubacijo se izberejo oplojena jajca, ki so bila odložena pred največ 10 dnevi;
4. Vzamejo nekontaminirana jajčeca, ker jih ni mogoče oprati pred inkubacijo, umazana jajčeca pa so manj vidna pri pregledu (ovoskopija) in pri delu z njimi lahko pride do okužbe zarodka med manipulacijo;
Jajca inkubiramo v inkubatorju ali v termostatu z ogrevanjem vode in dostopom zraka, med inkubacijo v termostatu pa moramo jajca 2-3 krat na dan obrniti in jih zaradi boljše izmenjave plinov vzeti ven za 5-10 ur. minut v zrak. Za vzdrževanje določene vlažnosti se v termostat postavi posoda z vodo za izparevanje, temperatura v termostatu naj bo 38°.
Razvoj zarodka se pojavi že prvi dan inkubacije, pride do polaganja možganov in okostja. Struktura piščančjega zarodka v starosti 7-9 dni(glej zvezek).
Za okužbo se najpogosteje uporabljajo zarodki, stari 7-12 dni. Delo s piščančjimi zarodki poteka v sterilni sobni škatli s strogim upoštevanjem aseptike.
Namen okužbe piščančjih zarodkov je:
1. Izolirajte podlogo iz patentnega materiala;
2. Proizvodnja cepiv;
3. Vzdrževanje virusa v laboratoriju;
4. Titracija virusov;
5. Biološki model za postavitev nevtralizacijske reakcije;
6. Študija interference virusa in produkcije interferona; Okužba piščančjih zarodkov:
Za okužbo je treba izbrati žive zarodke z dobro opredeljeno gibljivostjo. Pred okužbo vse zarodke natančno pregledamo v zatemnjeni sobi z ovoskopom.
Pri svečenju zarodkov pred okužbo se na lupini z navadnim svinčnikom začrta puga (zračna votlina), potek velikih krvnih žil in mesto izliva zarodka, to je predel na lupini, kjer zarodek leži najbližje. to. Oznaka mopsa, mesto predstavitve zarodka in potek velikih krvnih žil služijo nato kot vodilo pri izbiri mesta za vnos materiala, ki vsebuje virus, v času okužbe.
Piščančji zarodki, izbrani za okužbo, se prenesejo v boks, kjer se z njimi obdeluje. Pred okužbo se lupina na mestu vnosa materiala dvakrat obdela z jodiranim alkoholom in sežge. Doza okužbe je 0,1-0,2 cm.
Glede na vrsto virusa in namen okužbe so različni metode vnosa materiala, ki vsebuje viruse:
1) Okužba horioalantoične membrane , Za izolacijo in gojenje nevrotropnih, dermatropnih in nekaterih pantropskih virusov (male koze, encefalomielitis, ILT, slinavka in parkljevka, steklina, kuga itd.) se uporabljajo zarodki, stari 7-12 dni. Obstajajo 3 možnosti okužbe:
a) odprite pugo in jo odrežite s škarjami, ločite podlupinsko membrano in nanesite material na horioalantoično membrano (CAO). Luknjo v jajcu nato zapremo s sterilnim steklenim pokrovčkom, robove pokrovčka pa povoskamo;
b) izrežite trikotnik s stranico dolžine približno 1 cm v lupini z iglo (pilo) ali nazobčanim skalpelom na meji puje na strani predstavitve zarodka, odstranite del lupine in subzvezdno membrano s pinceto in vnesite material. Luknjo prekrijemo s sterilnim pokrovnim steklom, robove pa parafiniziramo ali zalepimo s sterilnim lepilnim trakom.
c) odstraniti s skalpelom majhno območje lupino s površino približno 0,5 cm na mestu, kjer je zarodek predstavljen, nato s pinceto ali iglo na tem območju odstranimo podlupinsko membrano in vbrizgamo material. Če se material ne prilega dobro v votlino jajca, lahko z gumijasto mehko izčrpamo zrak iz jajca skozi luknjo v lupini na jajcu in posledično nastane umetno jajce. mesto vnosa materiala, nato pa se material enostavno vstavi. Luknjo v lupini prekrijemo z lepilnim obližem ali povoskamo.
2) Okužba v alantoični votlini. Ta metoda okužbe je zelo preprosta in se uporablja za izolacijo številnih virusov. Za okužbo se vzamejo 10-11 dni stari zarodki. Obstajata dve možnosti okužbe:
a) okužba poteka skozi pugo, ne da bi jo odrezali. Z iglo izmerimo razdaljo od vrha puge do s svinčnikom označene meje puge na lupini in zabodemo iglo do označene globine ter jo poglobimo še za 0,5 cm, da prebodemo horioalantoisno membrano;
b) material se vstavi z iglo skozi luknjo v lupini na mestu predstavitve zarodka do globine 3-5 mm v avaskularnem območju. Luknjo v lupini prekrijemo z lepilnim obližem ali povoskamo.
3) Okužba v rumenjakovi vrečki. Za okužbo se uporabljajo 5-8 dni stari zarodki. Obstajata dve možnosti okužbe:
a) igla se vstavi s strani puje v rumenjakovo vrečko pod kotom 45 ° glede na mesto predstavitve zarodka pod nadzorom ovoskopa;
b) jajce se položi na stojalo s točko predstavitve zarodka navzdol in igla se zabode od zgoraj navzdol proti zarodku do globine približno 1 cm.
Mesto injiciranja je zalepljeno z lepilnim trakom in parafinirano. 4) Okužba v amnijski votlini. S to metodo okužbe lahko virus prodre in se razmnožuje v različnih celicah, ki so v stiku z amnijsko tekočino. Zaradi lažje okužbe je priporočljivo zarodke inkubirati 2-3 dni pred okužbo z brsti obrnjenimi navzgor. Nato se zarodek in amnion premakneta navzgor in je bolj priročno okužiti. Obstajata dve možnosti okužbe:
a) pugo odprite in odrežite, s pinceto odstranite podlupinsko membrano in zgrabite plodovnico, s pinceto potegnite plodovnico navzgor in vnesite material v odmerku 0,1 ml v amnijsko votlino. Luknjo v lupini nato zapremo s sterilno stekleno kapico in robove povoskamo;
b) okužba z dolgo iglo skozi pugo v temnem prostoru pod nadzorom oči se najprej upogne pod pravim kotom, da se ustvari majhno območje. Igla se vstavi pod nadzorom očesa skozi izboklino predzarodka, v tem primeru se pod pritiskom tope igle zarodek premakne, nato se amnion prebode z rahlim pritiskom; potegnil nazaj. V tem primeru se mora zarodek premakniti navzgor za iglo. Nato se uvede material.
5) Okužba v telo zarodka in okužba v možgane. Uporabljajo se 7-12 dni stari zarodki, okužba se izvede z vnosom materiala v različne dele telesa ali neposredno v možgane. Za okužbo se puga odpre in zarodek potegne navzgor s pinceto. Pri teh metodah okužbe lahko do 30 % ali več okuženih zarodkov umre zaradi poškodbe.
6) Okužba v velikih krvnih žilah horioalantoične membrane. Ta metoda okužbe, tako kot prejšnja, se uporablja zelo redko. Material se injicira s tanko iglo po odstranitvi lupine vzdolž krvne žile neposredno v žilo vzdolž krvnega obtoka.
Po okužbi je treba piščančje zarodke označiti s preprostim svinčnikom in postaviti v termostat. Dnevno jih spremljamo z ogledovanjem, opazovanje poteka do 7-8 dni, odvisno od vrste virusa. Če zarodki odmrejo, jih takoj vzamemo iz termostata in do odprtja postavimo v hladilnik. Če zarodek odmre v prvih 14-18 urah, je to lahko posledica poškodbe ali toksičnosti patološkega materiala. Zato je, tako kot pri okužbi laboratorijskih živali, v dvomljivih primerih priporočljivo narediti več prehodov in vzeti več zarodkov za vsak material.
Obdukcija mrtvih okuženih piščančjih zarodkov ali tistih, ki so bili odvzeti po poteku obdobja opazovanja, se izvaja v skladu z vsemi pravili asepse v sterilnih pogojih boksa. Ko se odpre, lupino obdelamo z alkoholom in zažgemo, nato pugo odrežemo. Iz odprtega zarodka najprej previdno izsesamo alantoično tekočino (njena količina je približno 7 ml), nato s pinceto potegnemo plodovnico nazaj, jo prebodemo s Pasteurjevo pipeto in izsesamo plodovnico (njena količina je 1,0- 1,5 ml), nato zberemo rumenjak, odstranimo membrane in zarodek. Tekočina, membrane in sam zarodek se natančno pregledajo glede sprememb. Plodovnica je običajno popolnoma bistra, pri okužbi pa je lahko motna in krvava. Značilne spremembe, ki jih povzroča virus, so najbolj izrazite na horioalantoični membrani: pojavijo se vnetna žarišča, neprozorna, okrogla oblika in krvavitve. Na telesu zarodka se lahko pojavijo krvavitve. Ves material se zbira v sterilnih posodah.
Piščančji zarodki se v virologiji široko uporabljajo ne le za izolacijo virusov, ampak tudi za kopičenje in pridobivanje antigenov, za pripravo živih in ubitih cepiv, titriranje virusov, za uprizoritev reakcije nevtralizacije virusa, za atenuacijo (oslabitev) virusov, za preučevanje interference virusov. virusi in pridobivanje interferona .
Večina znanih virusov ima sposobnost razmnoževanja v piščančjem zarodku (slika 4). Uporabimo zarodke, stare od 8 do 14 dni, odvisno od vrste virusa, načina okužbe in raziskovalnih ciljev. Virusi gripe se gojijo v 9-10 dneh, cepiva proti črnim kozam - v 12 dneh, mumpsu - v 7-dnevnih piščančjih zarodkih. Razmnoževanje virusa v piščančjih zarodkih se pojavi v različnih delih zarodka, kar je posledica značilnosti tropizma virusa. Tehnika gojenja virusa v piščančjem zarodku se pogosto uporablja v industrijskem gojenju.
Struktura piščančjega zarodka in načini njegove okužbe: 1 - v amnion; 2 - v alantoično votlino; 3 - v rumenjakovo vrečko. (Mikrobiologija in imunologija. Uredil Vorobyov A.A. - M. - 1999).
Najbolj zunanja zunajembrionalna membrana, ki meji na lupino ali materina tkiva in zato služi kot mesto izmenjave med zarodkom in njegovim okoljem, se imenuje horion. Pri vrstah, ki odlagajo jajca, je glavna funkcija horiona izmenjava dihalnih plinov. Pri sesalcih je horion vključen v dihanje in prehrano, izločanje, filtracijo in sintezo snovi. Pri primitivnih organizmih je horion sekundarna membrana, pri naprednih organizmih pa plodova membrana. Votlina med horionom in amnionom je horioamnijska votlina.
Amnion(grško Amnion), amnijska vreča ali vodna membrana - ena od embrionalnih ovojnic v zarodkih plazilcev, ptic in sesalcev.
Evolucijsko je amnion nastal za zaščito zarodkov pred izsušitvijo med razvojem izven vodnega okolja. Zato vretenčarje, ki ležejo jajca (plazilci in ptice), ter sesalce, ki izvirajo iz plazilcev, uvrščamo med amniote (»živali z jajčno membrano«). Prejšnji razredi in nadrazredi vretenčarjev (glavohordati, ciklostomi, ribe, dvoživke) odlagajo jajčeca v vodno okolje, zato ne potrebujejo vodne lupine. Ti razredi živali so združeni v skupino anamnije. Za razliko od anamnije amnioti ne potrebujejo vodnega okolja za razmnoževanje in zgodnji razvoj, zato amnioti niso pritrjeni na vodna telesa. To je evolucijska vloga amniona.
Med rojstvom pri sesalcih poči vodna ovojnica, voda odteče, ostanke amniona na telesu novorojenčka pa pogosto imenujejo »srajčka«, kar je že od davnine povsod znamenje sreče in drugih vraževerij. časih (od tod zlasti ruski pregovor o tistih, ki so bili »rojeni v srajci«).
Alantois (iz grščine allantoeid?s - klobasast) je embrionalni dihalni organ višjih vretenčarjev; zarodna membrana, ki se razvije iz zadnjega črevesa zarodka. Poleg tega je alantois vključen v izmenjavo plinov med zarodkom in okolju in sproščanje tekočih odpadkov. Alantois je skupaj z drugimi embrionalnimi membranami - amnionom in horionom - značilnost višjih vretenčarjev - sesalcev, ptic in plazilcev.
Pri jajčerodnih pticah in plazilcih se alantois razvije okoli zarodka vzdolž sten lupine. V svoji zunanji plasti, imenovani mezoderm, ustvari obsežno mrežo krvnih žil, prek katerih sodeluje z zunanje okolje. Pri sesalcih je alantois del popkovine.
Obstaja več načinov za okužbo razvijajočega se piščančjega zarodka: na horioalantoični membrani, v alantoični in amnijski votlini, rumenjakovem mešičku in telesu zarodka.
Z okužbo horioalantoične membrane izoliramo in gojimo viruse, ki tvorijo plake na membranah (cepni virusi, črne koze, herpes simpleks). Pred okužbo jajčeca pregledamo z ovoskopom in s svinčnikom začrtamo mejo zračnega prostora in horioalantoične membrane. Površino jajčeca nad zračnim prostorom in na mestu okužbe obrišemo z alkoholom, sežgemo, obdelamo z jodom in naredimo luknjo v votlini zračne vrečke.
Na mestu okužbe odstranimo lupino, da ne poškodujemo podlupine, ki jo nato prebodemo s kratko sterilno iglo, da ne poškodujemo horioalantoisne membrane. Zrak iz votline zračnega meha se izsesa. Virusni material (0,05 - 0,2 ml) se nanese na horioalantoisno membrano s tuberkulinsko brizgo s kratko iglo ali Pasteurjevo pipeto. Luknjo v lupini pokrijemo s sterilnim pokrovnim steklom ali enakim izžaganim kosom lupine, robove pa napolnimo s staljenim parafinom. Okužene zarodke postavimo vodoravno na stojalo in inkubiramo v termostatu. Zarodki se secirajo ne prej kot po 48 urah inkubacije. Na okuženi membrani se pojavijo belkaste motne lise različnih oblik (plaki).
Okužba v alantoični votlini. Virus, vnesen v alantois, se razmnožuje v endodermalnih celicah, nato pa preide v alantoično tekočino. Okužba se izvede na naslednji način: v lupini nad zračno komoro se s konico skalpela ali škarij naredi vbod, nato pa se igla z brizgo vstavi skozi luknjo v navpični smeri, ki poteka skozi korioalantoične membrane in vstopi v alantoično votlino, material se injicira v prostornini 0,1 ml in luknja se napolni s parafinom.
Okužba v rumenjakovi vrečki. V ta namen se uporabljajo zarodki, stari od 5 do 10 dni. Najpogostejša sta dva načina okužbe. Po prvem se material vnaša skozi zračni prostor. V sredini jajca naredimo luknjo, jo postavimo na stojalo s topim koncem v desno in skozi luknjo vstavimo iglo, ki je pritrjena na brizgo v navpični smeri; alantoične votline v rumenjak. V rumenjakovo vrečko lahko injiciramo od 0,1 do 0,5 ml materiala, ki vsebuje virus. Po okužbi se luknja v lupini napolni s parafinom in zarodek postavi v termostat. Po drugi metodi se na meji zračnega prostora na strani, kjer leži rumenjak (na strani, ki je nasprotna od zarodka), naredi luknja v lupini, skozi katero se vnese kužni material. Igla mora biti usmerjena proti sredini jajca.
Piščančji zarodek, okužen z virusnim materialom, se postavi v inkubator za 2-3 dni, odvisno od narave vnesenega virusa. Za razvoj virusov iz vzorcev, odvzetih bolniku (na primer nazofaringealnih brisov, ki se uporabljajo za diagnosticiranje gripe), je piščančji zarodek dobro okolje. Po vrsti sprememb, recimo v tkivih horioalantoične membrane, lahko neposredno ugotovimo, s kakšno vrsto virusa imamo opravka. Virus črnih koz in herpesa povzroči zelo značilne spremembe. Nekateri virusi se zelo intenzivno razmnožujejo v različne tkanine piščančji zarodek in daj surovina za pripravo virusnih antigenov, potrebnih za laboratorijska diagnostika virusne bolezni. Virusi, razmnoženi v piščančjem zarodku, so bili uporabljeni kot začetni material za pridobitev osemnajstih vrst cepilnih cepiv.
Kljub pozitivne strani celičnih kultur, ki so postale tako razširjene v sodobnih viroloških laboratorijih, je piščančji zarodek v mnogih primerih ohranil svoj primat in še naprej služi klasični material za delo. Indikacija virusa v piščančjem zarodku je smrt zarodka, pozitivna hemaglutinacijska reakcija na steklu z alantoično ali amnijsko tekočino, nastanek žariščnih lezij ("plakov") na horionsko-alantoični membrani, kot tudi v RHA.
Kazalo teme "Gojenje bakterij. Metode gojenja bakterij. Znaki kolonij.":Vse vrste celic ne morejo rasti v obliki monoslomona; v nekaterih primerih je ohranjanje diferenciranih celic možno le v orgelska kultura. Običajno gre za suspenzijo tkiva, ki ima posebno funkcijo, imenovano tudi preživela tkivna kultura.
Piščančji zarodki(Sl. 11-20) so skoraj idealni modeli za gojenje nekaterih virusov (na primer gripe in ošpic). Zaprta votlina zarodka preprečuje prodiranje mikroorganizmov od zunaj, pa tudi razvoj spontanih virusne okužbe. Zarodki se uporabljajo za primarno izolacijo virusov iz patološkega materiala; za njihovo pasažo in ohranjanje ter za pridobivanje potrebnih količin virusa. Nekateri povzročitelji (na primer virusi herpesa) povzročajo značilne spremembe (po njih lahko prepoznamo bolezen). Okužba se izvaja na horionsko-alantoični membrani, v amnijski ali alantoični votlini ali v rumenjakovi vrečki.
Virusna okužba na horionsko-alantoični membrani. Običajno se uporabljajo 10-12 dni stari zarodki. Jajca si ogledamo v presvetljeni svetlobi, zabeležimo lokacijo zračnega mešička in izberemo območje brez krvnih žil. Previdno odstranite delček lupine, sprostite zunanjo lupino in jo z nežnim pritiskom odlepite. Nato se na robu zračne vrečke naredi luknja. Pri sesanju skozi to luknjo se horionsko-alantoična membrana odlušči od zunanje membrane. Nanj se nanese testni material brez bakterij in protozojev (prepuščen skozi bakterijske filtre in obdelan z baktericidi). Okužba v amnijski votlini. Običajno se uporabljajo 7-14 dni stari zarodki, pri katerih se po ločitvi horionsko-alantoične membrane (glej zgoraj) razširi odprtina, amnijska membrana se zgrabi s pinceto in odstrani skozi horionsko-alantoisno membrano. Preko njega se preskusni material vnese v amnijsko votlino.
Virusna okužba v alantoični votlini. 10 dni stari zarodki se okužijo skozi luknje, narejene v lupini in spodnjih membranah (glej zgoraj).
Virusna okužba v rumenjakovi vrečki. Uporabljajo se 3-8 dni stari zarodki, pri katerih v tej starosti rumenjak zavzema skoraj celotno jajčno votlino. Okužba poteka skozi luknjo v zračnem mešičku.
riž. 11-20. Shematski prikaz razvijajočega se piščančjega zarodka.
Vsebina se lahko uporablja kot gradivo, ki vsebuje viruse rumenjakova vrečka, alantoično in amnijsko tekočino ali celoten zarodek, razrezan na koščke skupaj z okoliškimi tkivi. Za identifikacijo značilnih lezij na horionsko-alantoični membrani odstranimo lupino in zunanjo membrano. Membrano nato odstranimo in damo v sterilno vodo. Narava lezij se preučuje na temnem ozadju.
Dober dan, dragi bralci! Danes bomo podali opis, prikazali fotografije in videoposnetke o razvoju piščanca v jajcu vsak dan med inkubacijo doma in na perutninskih farmah. Samozavestno se izvaja tako v tovarniškem obsegu kot na zasebnih kmetijah.
Toda kljub široki uporabi le malo ljudi razmišlja o tem zapleten mehanizem, določeno na genetski ravni, ki zagotavlja rast in razvoj piščanca.
Še vedno obstaja mnenje, da piščanec raste iz rumenjaka. V tem članku boste izvedeli vse skrivnosti, ki se skrivajo pod besedama alantois pri piščancu in amnion pri piščancu ter kakšen "grozen" pomen skrivata besedi in kakšno funkcijo opravljata.
Razvoj piščanca se začne z blastodiskom. Blasodisk je majhen strdek citoplazme, ki se nahaja na površini rumenjaka. Na mestu blastodiska je gostota rumenjaka precej manjša, kar prispeva k stalnemu lebdenju rumenjaka z blastodiskom navzgor.
Ta funkcija zagotavlja boljše ogrevanje med procesom inkubacije. Oplojeni blastodisk se začne deliti, ko je še v telesu piščanca in ko je znesen, je že popolnoma obdan z blastodermom. Blastodisk je videti kot majhna bela lisa, velika približno 2 mm.
Svetel halo, ki v obroču obdaja zarodno ploščico, je blastoderm.
Ko jajčece vstopi v ugodne okoljske razmere in se po odlaganju ustavi, se celična delitev nadaljuje.
Morala bi vedeti: V nasprotju s splošnim prepričanjem, da se ovoskopiranje lahko izvaja šele od 6. dne inkubacije, je razvoj blastoderme jasno viden po 18-24 urah od začetka inkubacije. Na tem mestu je jasno vidna potemnitev s premerom 5–6 mm, ki se zlahka premika, ko jajce obrnemo.
2.–3. dan inkubacije se začne razvoj začasnih membran:
Vsi so pravzaprav začasni organi, namenjeni opravljanju funkcij zagotavljanja vitalne aktivnosti zarodka do njegove končne tvorbe.
Je lupina, ki ščiti zarodek pred fizičnimi udarci in izsušitvijo, zahvaljujoč polnjenju s tekočino. Piščančji amnion uravnava količino tekočine glede na starost zarodka.
Epitelijska površina amnijske vrečke je sposobna napolniti votlino z zarodkom z vodo in zagotavlja tudi odtok tekočine, ko raste.
Eden od začasnih organov, ki opravlja številne funkcije:
Piščančji alantois med rastjo ustvari razvejano žilno mrežo, ki obloži celotno notranjo površino jajčeca in se preko popkovine poveže s piščančkom.
Izmenjava kisika v jajcu ima drugačen mehanizem, odvisno od stopnje razvoja piščanca. V začetni fazi razvoja pride kisik iz rumenjaka neposredno v celice blastoderme.
S pojavom cirkulacijskega sistema kisik vstopi v kri, še vedno iz rumenjaka. Toda rumenjak ne more v celoti zagotoviti dihanja hitro rastočega organizma.
Od 6. dne se funkcija zagotavljanja kisika postopoma prenese na alantois. Njegova rast se začne proti zračni komori jajca in, ko jo doseže, pokriva vedno večjo notranjo površino lupine. Večji ko piščanec raste, večjo površino pokriva alantois.
Ko je ovoskopsko, je videti kot rožnata mreža, ki pokriva celotno jajce in se zapira na ostri strani.
V prvih dneh razvoja zarodek uporablja hranila iz beljakovin in rumenjaka. Ker rumenjak vsebuje celoten kompleks mineralov, maščob in ogljikovih hidratov, je sposoben zagotoviti vse začetne potrebe rastočega telesa.
Po zaprtju alantoisa (11. dan razvoja) pride do prerazporeditve funkcij. Zarodek postane večji in zavzame položaj vzdolž dolge osi jajčeca, z glavo proti topemu koncu. Beljakovine so na tej točki koncentrirane na ostrem koncu jajca.
Teža piščanca, skupaj s pritiskom alantoisa, zagotavlja premik beljakovine in njeno prodiranje skozi amnion v usta zarodka. Ta neprekinjen proces zagotavlja hitro rast in razvoj piščanca v jajcu dan za dnem med inkubacijo.
Od 13 dni minerali, ki jih piščanec porabi za nadaljnji razvoj, prinaša alantois iz lupine.
Vedeti morate: normalno prehrano piščanca lahko zagotovi le pravočasno zaprt alantois v piščancu. Če oster konec jajca še vedno vsebuje beljakovine, ki niso prekrite z žilami, ko je zaprto, piščanec ne bo imel dovolj hranil za nadaljnjo rast.
V zadnjem času je vse pogostejša inkubacija piščančjih jajc v navpičnem položaju. Toda ta metoda nima najboljšega učinka na razvoj piščanca.
V navpičnem položaju je največji nagib pri obračanju 45°. Ta naklon ni dovolj za normalno rast alantoisa in njegovo pravočasno zaprtje. To še posebej velja za velika jajca.
Pri inkubaciji v vodoravnem položaju je zagotovljena rotacija za 180 °, kar pozitivno vpliva na rast alantoisa in posledično na prehrano piščanca.
Puhački, izvaljeni z jajci, položenimi navpično, tehtajo praviloma 10 % manj kot tisti, izvaljeni z jajci, položenimi vodoravno.
Obračanje jajc med inkubacijo je potrebno na vseh stopnjah razvoja, razen prvega dne in zadnjih dveh. V prvem dnevu je potrebno intenzivno segrevanje blastodiska, zadnji dan pa je mali piskar že zavzel položaj za prebijanje lupine.
V začetnih fazah razvoja obračanje jajčec odpravi tveganje, da bi se blastoderm ali amnion prilepil na notranjost lupine.
Vrtenje pomaga tudi:
Zdaj, ko smo prebrali članek, lahko ocenimo kompleksnost procesov, ki se pojavljajo pri majhnem petelinu ali kokoši med njegovim razvojem iz več celic v majhno ptico. Ta proces ni nič manj zapleten kot razvoj človeškega otroka ali na primer mačjega mladiča v maternici, kjer so zagotovljeni stalni pogoji.
Razvoj piščanca v jajcu čez dan je popolnoma odvisen od zunanjih pogojev, katerih zagotavljanje je inkubacija.
Vsem želimo uspešno izleganje rumenih, sivih in ostalih puhčkov!
Naročite se na posodobitve spletnega mesta, da boste prvi izvedeli novice o piščancih, ki bodo pomagale rešiti vse vaše težave.
Tukaj je fotografija naše redne bralke Julije Arepteve, pod katero je bil piščanec izvaljen!
V komentarje lahko dodate svoje fotografije kokoši nesnic, petelinov in piščančkov! Ali drugo perutnino. Zanima nas, kakšen kurnik imate?
Vam je bil članek všeč? Delite s prijatelji na družbenih omrežjih: 
Pridružite se nam na VKontakte, preberite o piščancih!
