Velik pomen v razvoju virologije je bila uvedba metod za gojenje virusov v piščančji zarodki. Za razmnoževanje virusa se uporabljajo piščančji zarodki, stari 7-12 dni, inkubirani v termostatu pri 37 C. Nujen pogoj Za pravilen razvoj zarodka je potrebno vzdrževati določeno zračno vlago, ki jo ustvarimo tako, da posodo z vodo postavimo v termostat. Gojenje virusov v piščančjih zarodkih se izvaja v različni kraji zarodek, ki je okužen:
1) na horionsko-alantoični membrani;
2) v alantoično votlino;
3) v amnijsko votlino;
4) v rumenjakovo vrečko.
Okužba piščančjih zarodkov se izvaja v škatli s sterilnimi instrumenti. Pred: okužbo, piščančje zarodke dvakrat obrišemo z vatirano palčko, navlaženo z alkoholom.
Okužba horionsko-alantoične membrane. Po dezinfekciji jajca previdno odrežite košček lupine s topega konca, odstranite podlupinsko membrano - to razkrije horionsko-alatioično membrano. Infektivni material v količini 0,1-0,2 ml se nanese na horionsko-alantoično membrano z brizgo ali Pasteurjevo pipeto. Po okužbi se luknja zapre s pokrovčkom in vrzel med njo in piščančjim zarodkom napolni s parafinom. Na drugo stran jajčeca s preprostim svinčnikom napišite ime kužnega materiala in datum okužbe.
Okužba v amnijski votlini. Jajce je ovoskopsko in na lateralni strani je izbrano območje, kjer je horion-alantois brez velikih krvnih žil. To območje je označeno s svinčnikom. Jajca postavimo na stojalo v vodoravnem položaju, jih razkužimo in s posebno sterilno šilko preluknjamo luknjo. in lupina do globine 2-3 mm, skozi katero se igla z infekcijskim materialom vstavi na enaki razdalji neposredno v amnijsko votlino. Da preprečimo, da bi vbrizgana tekočina stekla nazaj, najprej naredimo punkcijo nad zračnim mešičkom. Po tem sta obe luknji napolnjeni s parafinom.
Okužba v alantoični votlini. Okužba poteka tudi v zasenčenem boksu. Zračni prostor označimo, lupino nad zračnim prostorom razkužimo in skozi luknjico v lupini proti zarodku vstavimo iglo brizge z materialom. Če igla vstopi v alantoično votlino, opazimo premik sence zarodka. Po okužbi se luknja napolni s parafinom.
Okužba v rumenjakovi vrečki. Lupina je razkužena. Jajce položimo na stojalo s topim koncem v desno, tako da je oznaka rumenjaka obrnjena navzgor. V sredini nad zračno komoro je prebodena luknja. Skozi luknjo v lupini se v vodoravni smeri vstavi igla brizge do globine 2-3 mm, ki vstopi v rumenjakovo vrečko. Material se daje v prostornini 0,2-0,3 ml. Po vnosu materiala luknjo povoskamo.
Temperatura in trajanje inkubacije sta odvisna od bioloških lastnosti ta virus. Okužena jajčeca se dnevno pregledujejo in ovoskopirajo, da se preveri sposobnost preživetja zarodka. Če zarodki odmrejo prvi dan, je vzrok običajno travma med okužbo. Takšna jajca so izvaljena iz izkušenj. Prisotnost virusa v okuženem zarodku ugotavljajo značilne spremembe v horionsko-alantoisni membrani okuženega piščančjega zarodka. Virusi, ki nimajo hemagpotinacijske aktivnosti, se odkrijejo z RSC. Za odkrivanje virusa v alantoični ali amnijski tekočini okuženih zarodkov se izvaja RGA.
Večina znanih virusov ima sposobnost razmnoževanja v piščančjem zarodku (slika 4). Uporabimo zarodke, stare od 8 do 14 dni, odvisno od vrste virusa, načina okužbe in raziskovalnih ciljev. Virusi gripe se gojijo v 9-10 dneh, cepiva proti črnim kozam - v 12 dneh, mumpsu - v 7-dnevnih piščančjih zarodkih. Razmnoževanje virusa v piščančjih zarodkih se pojavi v različnih delih zarodka, kar je posledica značilnosti tropizma virusa. Tehnika gojenja virusa v piščančjem zarodku se pogosto uporablja v industrijskem gojenju.
Struktura piščančjega zarodka in načini njegove okužbe: 1 - v amnion; 2 - v alantoično votlino; 3 - v rumenjakovo vrečko. (Mikrobiologija in imunologija. Uredil Vorobyov A.A. - M. - 1999).
Najbolj zunanja zunajembrionalna membrana, ki meji na lupino ali materina tkiva in zato služi kot mesto izmenjave med zarodkom in njegovim okoljem, se imenuje horion. Pri vrstah, ki odlagajo jajca, je glavna funkcija horiona izmenjava dihalnih plinov. Pri sesalcih je horion vključen v dihanje in prehrano, izločanje, filtracijo in sintezo snovi. Pri primitivnih organizmih je horion sekundarna membrana, pri naprednih organizmih pa plodova membrana. Votlina med horionom in amnionom je horioamnijska votlina.
Amnion(grško Amnion), amnijska vreča ali vodna membrana - ena od embrionalnih ovojnic v zarodkih plazilcev, ptic in sesalcev.
Evolucijsko je amnion nastal za zaščito zarodkov pred izsušitvijo med razvojem izven vodnega okolja. Zato vretenčarje, ki ležejo jajca (plazilci in ptice), ter sesalce, ki izvirajo iz plazilcev, uvrščamo med amniote (»živali z jajčno membrano«). Prejšnji razredi in nadrazredi vretenčarjev (glavohordati, ciklostomi, ribe, dvoživke) odlagajo jajčeca v vodno okolje, zato ne potrebujejo vodne lupine. Ti razredi živali so združeni v skupino anamnia. Za razliko od anamnije amnioti ne potrebujejo vodnega okolja za razmnoževanje in zgodnji razvoj, zato amnioti niso pritrjeni na vodna telesa. To je evolucijska vloga amniona.
Med rojstvom pri sesalcih poči vodna ovojnica, voda odteče, ostanke amniona na telesu novorojenčka pa pogosto imenujejo »srajčka«, kar je že od davnine povsod znamenje sreče in drugih vraževerij. časih (od tod zlasti ruski pregovor o tistih, ki so bili »rojeni v srajci«).
Alantois (iz grščine allantoeid?s - klobasast) je embrionalni dihalni organ višjih vretenčarjev; zarodna membrana, ki se razvije iz zadnjega črevesa zarodka. Poleg tega je alantois vključen v izmenjavo plinov med zarodkom in okolju in sproščanje tekočih odpadkov. Alantois je skupaj z drugimi embrionalnimi membranami - amnionom in horionom - značilnost višjih vretenčarjev - sesalcev, ptic in plazilcev.
Pri jajčerodnih pticah in plazilcih se alantois razvije okoli zarodka vzdolž sten lupine. V svoji zunanji plasti, imenovani mezoderm, ustvari obsežno mrežo krvnih žil, prek katerih sodeluje z zunanje okolje. Pri sesalcih je alantois del popkovine.
Obstaja več načinov za okužbo razvijajočega se piščančjega zarodka: na horioalantoični membrani, v alantoični in amnijski votlini, rumenjakovem mešičku in telesu zarodka.
Z okužbo horioalantoične membrane izoliramo in gojimo viruse, ki tvorijo plake na membranah (cepni virusi, črne koze, herpes simpleks). Pred okužbo jajčeca pregledamo z ovoskopom in s svinčnikom začrtamo mejo zračnega prostora in horioalantoične membrane. Površino jajčeca nad zračnim prostorom in na mestu okužbe obrišemo z alkoholom, sežgemo, obdelamo z jodom in naredimo luknjo v votlini zračne vrečke.
Na mestu okužbe odstranimo lupino, da ne poškodujemo podlupine, ki jo nato prebodemo s kratko sterilno iglo, da ne poškodujemo horioalantoisne membrane. Zrak iz votline zračnega meha se izsesa. Virusni material (0,05 - 0,2 ml) se nanese na horioalantoisno membrano s tuberkulinsko brizgo s kratko iglo ali Pasteurjevo pipeto. Luknjo v lupini pokrijemo s sterilnim pokrovnim steklom ali enakim izžaganim kosom lupine, robove pa napolnimo s staljenim parafinom. Okužene zarodke postavimo vodoravno na stojalo in inkubiramo v termostatu. Zarodki se secirajo ne prej kot po 48 urah inkubacije. Na okuženi membrani se pojavijo belkaste motne lise različnih oblik (plaki).
Okužba v alantoični votlini. Virus, vnesen v alantois, se razmnožuje v endodermalnih celicah, nato pa preide v alantoično tekočino. Okužba se izvede na naslednji način: v lupini nad zračno komoro se s konico skalpela ali škarij naredi vbod, nato pa se igla z brizgo vstavi skozi luknjo v navpični smeri, ki poteka skozi korioalantoične membrane in vstopi v alantoično votlino, material se injicira v prostornini 0,1 ml in luknja se napolni s parafinom.
Okužba v rumenjakovi vrečki. V ta namen se uporabljajo zarodki, stari od 5 do 10 dni. Najpogostejša sta dva načina okužbe. Po prvem se material vnaša skozi zračni prostor. V sredini jajčeca naredimo luknjo, jo postavimo na stojalo s topim koncem v desno in skozi luknjo v navpični smeri vstavimo iglo, pritrjeno na brizgo; alantoične votline v rumenjak. V rumenjakovo vrečko lahko injiciramo od 0,1 do 0,5 ml materiala, ki vsebuje virus. Po okužbi se luknja v lupini napolni s parafinom in zarodek postavi v termostat. Po drugi metodi se na meji zračnega prostora na strani, kjer leži rumenjak (na strani, ki je nasprotna od zarodka), naredi luknja v lupini, skozi katero se vnese kužni material. Igla mora biti usmerjena proti sredini jajca.
Piščančji zarodek, okužen z virusnim materialom, se postavi v inkubator za 2-3 dni, odvisno od narave vnesenega virusa. Za razvoj virusov iz vzorcev, odvzetih bolniku (na primer nazofaringealnih brisov, ki se uporabljajo za diagnosticiranje gripe), je piščančji zarodek dobro okolje. Po vrsti sprememb, recimo v tkivih horioalantoične membrane, lahko neposredno ugotovimo, s kakšno vrsto virusa imamo opravka. Virus črnih koz in herpesa povzroči zelo značilne spremembe. Nekateri virusi se zelo intenzivno razmnožujejo v različne tkanine piščančji zarodek in daj surovina za pripravo virusnih antigenov, potrebnih za laboratorijska diagnostika virusne bolezni. Virusi, razmnoženi v piščančjih zarodkih, so bili uporabljeni kot začetni material za proizvodnjo osemnajstih vrst cepiv za cepljenje.
Kljub pozitivne strani celičnih kultur, ki so postale tako razširjene v sodobnih viroloških laboratorijih, je piščančji zarodek v mnogih primerih ohranil svoj primat in še naprej služi klasični material za delo. Indikacija virusa v piščančjem zarodku je smrt zarodka, pozitivna hemaglutinacijska reakcija na steklu z alantoično ali amnijsko tekočino, nastanek žariščnih lezij ("plakov") na horionsko-alantoični membrani, kot tudi v RHA.
Namen lekcije: seznaniti študente z metodami okužbe piščančjih zarodkov za gojenje virusov.
Oprema in materiali: piščančji zarodki 9-12 dni inkubacije, ovoskop, alkoholne blazinice, stojala za zarodke, pincete, škarje, lepilni trak, igle, brizge, svinčniki, luknjači, igle, tabele, diagrami, multimedijska oprema, predstavitve MS Office Power Point na temo lekcije.
Način okužbe pomembno vpliva na razmnoževanje virusov v zarodkih. Pred okužbo inkubirana jajca svečimo, odmrla pa ločimo. Na lupinah jajčec z živimi zarodki, ki jih odlikuje rdeča barva žilic in premikanje zarodka, s svinčnikom označimo mesto okužbe.
Zarodke okužimo v sterilnem boksu z delovno mizo, dvema stolčkoma, dovodom plina, dovodom vode in vakuumom. Okužba v amnijsko votlino se izvaja v zatemnjenem prostoru. Delovno mesto mora biti dobro osvetljen. Pred delom se miza razkuži. Za dezinfekcijo površine jajc pripravimo antiseptično raztopino (70% alkohol, 2% raztopina joda) in jo zavijemo v vato. lesena palica, upognjena zobna sonda ali sveder za vrtanje jajčne lupine. Jajca se okužijo s sterilnimi brizgami za tuberkulinizacijo in posebnimi iglami. Okuženo mesto na jajčecu napolnimo s parafinom. Za to pripravimo parafinske palčke: stekleno paličico vstavimo v epruveto, napolnjeno s staljenim parafinom, in pazimo, da je v središču epruvete, dokler se parafin ne ohladi.
Ko potrebujemo parafinsko palčko, stene epruvete segrejemo na gorilniku in s stekleno paličico potegnemo parafin iz epruvete. Držite palico nad ognjem in stopite toliko parafina, da zaprete luknjo v jajcu. Ta metoda je zelo čista in ne proizvaja parafinskih hlapov.
Poleg tega se na delovno mizo v škatli postavi kozarec s sterilnimi vatiranimi palčkami, kozarec s 3% raztopino kavstične sode za rabljene instrumente in posoda z raztopino kloramina za rabljene steklene predmete. Po potrebi lahko pripravite jajčno skodelico, majhno emajlirano skodelico in sterilna gojišča. Tako pripravljeno delovno mizo izpostavimo UV obsevanju 1-2 uri.
Glede na patogenost proučevanih virusov se delo izvaja z masko, gumijastimi rokavicami in zaščitnimi očali.
Obstaja šest načinov za okužbo zarodkov. Najpogosteje se uporablja okužba v alantoisno votlino in horioalantoisno membrano, redkeje v amnijsko votlino in v rumenjak, zelo redko pa v telo zarodka in v krvne žile CAO. Izbira metode je odvisna od tropizma virusa in namena okužbe. Pri kateri koli metodi okužbe se injicira 0,1-0,2 ml kužnega materiala.
Pri okužbi s to metodo se dobro razmnožujejo virusi gripe, atipične kokošje kuge, konjske rinopnevmonije, vezikularnega stomatitisa itd. Obstaja več variant metode.
Prva možnost. Zarodek je fiksiran navpično s topim koncem navzgor. V lupini na strani zarodka, včasih na nasprotni strani zarodka, 5-6 mm nad robom zračne komore, se naredi luknja s premerom približno 1 mm. Igla se vstavi vzporedno z vzdolžno osjo do globine 10-12 mm (slika 16). Po injiciranju materiala, ki vsebuje virus, iglo odstranimo in luknjo v lupini zapremo s kapljico stopljenega sterilnega parafina.
Slika 16. Okužba v alantoični votlini (prva možnost) (po Nikolaouju)
Druga možnost. Luknja, narejena v ohišju nad zračno komoro, se uporablja samo za izpust zraka. Sama luknja za infekcijo se naredi v predelu avaskularne cone horioalantoične membrane (CAO) ob strani zarodka. Igla se vstavi do globine največ 2-3 mm. Vbrizgajte kužno tekočino v volumnu 0,1-0,2 ml in zaprite luknjo s parafinom (glej sliko 17).
Ta metoda okužbe piščančjih zarodkov se pogosto uporablja za gojenje epiteliotropnih in pantropskih virusov črnih koz, infekcijskega laringotraheitisa ptic, kuge, bolezni Aujeszkega, bolezni modrikastega jezika itd.
Takšna okužba se lahko izvede prek naravne ali umetne zračne komore.
Za okužbo skozi naravno zračno komoro zarodek se postavi navpično na stojalo s topim koncem navzgor in v lupini proti sredini zračne komore se izreže okroglo okence s premerom 15-20 mm. Skozi to okence se s pinceto odstrani podlupinasta membrana. 0,2 mm suspenzije, ki vsebuje virus, se nanese na izpostavljeno območje CAO (slika 18), luknja se zapre z lepilnim obližem ali redkeje s pokrivnim steklom, utrjenim s staljenim parafinom.
Okužba skozi komoro z umetnim zrakom se uporablja pogosteje kot prvi, saj zagotavlja stik materiala, ki vsebuje virus, z večjo površino CW in s tem povzroči nastanek večje količine virusa.
Slika 17. Okužba piščančjega zarodka v alantoični votlini (druga možnost) (po Nikolaouju)
Slika 18. Okužba pri KhAO skozi naravno zračno komoro (po Nikolaou et al.)
Slika 19. Okužba piščančjega zarodka v KhAO skozi umetno zračno komoro (po Nikolaou et al.)
Če želite okužiti zarodek s to metodo, ga postavite vodoravno v stojalo z zarodkom obrnjen navzgor. V lupini sta narejeni dve luknji: ena majhna nad sredino zračne komore (zasnovana za sesanje zraka iz nje), druga pa s premerom 0,2-0,5 cm na strani, na strani zarodka. Kompleksnost metode je v tem, da morate pri izdelavi druge luknje najprej previdno odstraniti kos lupine, nato pa z drsečim gibom, ne da bi pri tem poškodovali kemično snov, premakniti lupino na stran, da lahko zrak prehaja skozi nastalo okvara. Po tem se zrak izsesa iz naravne zračne komore s pomočjo gumijaste mehurčke skozi prvo luknjo (slika 19, a). Kot rezultat, skozi stransko luknjo vstopi zunanji zrak, ki tvori umetno zračno komoro, dno). od tega je XAO (slika 19, b).
Skozi stransko luknjo nanesemo kužno tekočino na površino CAO in luknjo zapremo s kosom lepilnega traku. Prve luknje ni treba zapreti, saj se notranja plast membrane lupine s to metodo okužbe ne poškoduje in še naprej deluje kot ovira za okoljsko mikrofloro.
Nadaljnja inkubacija zarodkov, okuženih s to metodo, poteka v vodoravnem položaju s stransko odprtino navzgor.
Večinoma se uporablja za razmnoževanje klamidije, pa tudi virusov Marekove bolezni, konjske rinopnevmonije, bolezni modrikastega jezika ovac itd. Okužijo zarodke stare 5-7 dni, včasih pa tudi 2-3 dni (RIF). virus dolinske mrzlice). Uporabljata se dve možnosti okužbe.
Prva možnost. Zarodki so nameščeni v stojalu v navpičnem položaju. V lupini se naredi luknja nad sredino zračne komore in igla se zabode do globine 3,5-4 cm pod kotom 45 ° glede na navpično os v smeri, nasprotni lokaciji zarodka (slika 1). 20).
Slika 20. Okužba piščančjega zarodka v rumenjak (po Nicolaou et al.)
Druga možnost. Včasih se podobna pot okužbe izvaja na zarodku, ki je vodoravno nameščen v stojalu; v tem primeru je zarodek spodaj, rumenjak pa nad njim. Luknjo v lupini zapremo s kapljico staljenega parafina.
V ta namen se uporabljajo zarodki, stari od 6 do 10 dni. Metoda se uporablja za kultivacijo virusov gripe, atipične kokošje kuge, konjske rinopnevmonije itd. Obstajata dva načina okužbe.
Zaprta metoda. Okužba se izvaja v zatemnjeni škatli. Jajce se položi na ovoskop v vodoravnem položaju z zarodkom navzgor. Skozi luknjo v lupini nad zračno komoro proti zarodku se zabode igla s topim koncem. Dokaz, da je igla prodrla v amnion, je premik plodovega telesa v smeri gibanja.
Odprta metoda. Lupina nad zračno komoro se izreže tako, da se oblikuje okno s premerom 1,5-2,5 cm, skozi katero se s pinceto pod nadzorom očesa odstrani podlupina. Nato se vodi anatomska (14 cm) pinceta z zaprtimi čeljustmi, ki potisne horioalantoisno membrano proti zarodku. Ko ga pinceta doseže, se čeljusti odprejo, zgrabijo amnijsko membrano skupaj s CAO in jo potegnejo do okna. Z levo roko držite pinceto z amnijsko membrano, ki je v njej pritrjena, vnesete material, ki vsebuje virus (slika 21). Nato spustimo vse membrane, okence zapremo z lepilnim obližem in zarodek inkubiramo v navpičnem položaju.
Slika 21. Okužba piščančjega zarodka v amnion po odprti metodi (po Nikolaouju in sod.)
Pri ovoskopiranju 11-13 dni starih zarodkov opazimo veliko krvno žilo. Ko napreduje, odstranimo del lupine, kanemo 1-2 kapljici alkohola, zaradi česar je lupina za nekaj časa prozorna. Pod nadzorom oči z ovoskopom se igla vstavi v žilo, kar potrdimo z njeno mobilnostjo z majhnimi stranskimi premiki igle. Izpostavljeno območje podlupinaste membrane je prekrito s kosom lepilnega ometa.
Material lahko vnesemo v žile tudi na nekoliko drugačen način: odrežemo lupino nad zračno komoro, podlupino membrano navlažimo z alkoholom in material vnesemo v posode XAO, ki so postale vidne. Luknjo prekrijemo s sterilnim lepilnim trakom.
Opisane tehnične metode poskusne okužbe piščančjih zarodkov niso edine, temveč imajo različne možnosti.
Za okužbo se uporabljajo zarodki, stari 7-12 dni. Znani sta dve različici metode.
Prva možnost. Amnion okužijo na enak način kot v amnionu na zaprt način, z edino razliko, da vzamejo ostro iglo in na ovoskopu se šteje, da je indikator vstopa igle v telo podrejenost zarodka. na premike igle.
Druga možnost. Amnion okužijo na enak način kot na odprt način: skozi okno v lupini telo zarodka potegnejo navzgor s pinceto. Material se vbrizga v možgane ali določene dele telesa. Pri takšnih metodah okužbe je pomemben odstotek nespecifične smrti zarodka.
Pred nadaljnjo inkubacijo na lupino piščančjih zarodkov, okuženih na kateri koli način, z navadnim (grafitnim) svinčnikom napišejo, s čim je zarodek okužen in kdaj ter po potrebi še druge podatke. Okužene piščančje zarodke postavimo v termostat za nadaljnjo inkubacijo, med katero se vneseni virusi razmnožujejo in kopičijo v ustreznih strukturah. Inkubacijska temperatura zarodkov se giblje od 33 do 38 °C, odvisno od lastnosti virusa, s katerim je bila okužena. Zarodke stalno spremljamo, pregledujemo na ovoskopu in izbiramo odmrle.
Odmrt zarodkov v prvih 24 urah po okužbi je najpogosteje posledica razmnoževanja gliv, bakterijske mikroflore, vnesene v zarodek skupaj z inokulumom, ali poškodbe ob okužbi. Ta smrt velja za nespecifično. Pozneje zarodki praviloma umrejo zaradi razmnoževanja virusa v zarodkih. Po odkritju mrtvih zarodkov jih takoj prenesemo v hladilnik pri temperaturi 4 °C. Takšni pogoji po eni strani prispevajo k ohranjanju aktivnosti virusa, nabranega v zarodku, po drugi strani pa k zbijanju tkiv in izpraznjenosti krvnih žil, kar močno olajša kasnejšo disekcijo.
Zarodki se inkubirajo, dokler ne pride do največjega kopičenja virusa. Za vsak virus in celo sev je to obdobje specifično in se giblje od 2 do 7-8 dni. Tako je za sev virusa atipične kokošje kuge H 2-3 dni, za isti sev virusa B - 5 dni, za virus ptičjega infekcioznega laringotraheitisa - 5 dni itd. Nato vse zarodke ubijemo s hlajenjem pri 4 ° C za vsaj 3-4 ure in odprto.
Metoda temelji na odstranitvi zarodka iz jajčeca v obdobju, ko horioalantoična membrana od znotraj popolnoma meji na njegovo lupino. Če v takšno jajce dodamo hranilni medij, nastane nekakšna tkivna kultura, v kateri se virus lahko razmnožuje. Metoda ima številne prednosti: omogoča pridobitev čistejšega virusa kot v alantoično-amnijski tekočini, kar je pomembno za zmanjšanje alergenih lastnosti cepiv, pripravljenih iz tega materiala; Odsotnost rumenjakove vrečke in s tem specifičnih protiteles, ki jih vsebuje, omogoča nekaterim virusom boljše razmnoževanje. V nekaterih primerih ta metoda daje dobri rezultati pri diagnostičnem delu, saj omogoča vnos velikih količin testnega materiala, kar poveča možnost izolacije virusa.
Metodo je že leta 1949 predlagal Bernkopf, vendar zaradi težav pri uporabi ni v široki uporabi. Te težave so povezane z lastnostjo horioalantoične membrane, da se med inkubacijo loči od lupine, kar zmanjša vrednost kulture in oteži manipulacijo pridobivanja virusa in zamenjavo hranilnega medija.
E. Groiel (1963) je uvedel številne modifikacije, ki so odpravile te težave. Predlagal je uporabo 15 dni starih ali celo starejših jajc, ki jih je treba med inkubacijo pogosto obračati, da zagotovimo enakomeren razvoj lupine na jajčni lupini. Pri presvetlitvi so označene meje zračne komore. Lupino odžagamo 0,5 cm nad to črto, na rob lupine vlijemo staljen parafin (56-58 C°), ki se strdi in fiksira rob jajca. Nato se v membrani nad zarodkom izreže okrogla luknja, okoli katere ostane ozek rob. Naslednji korak je previdno odstranjevanje zarodka iz jajčeca. V tem primeru je treba jajce držati v vodoravnem položaju in ga počasi vrteti. Na ta način najdemo žile, ki povezujejo zarodek s CAO in jih prerežemo s škarjami. Če jajce držimo navpično, potem zarodek s svojo maso potegne lupino nazaj, običajno jo odtrga na območju ostrega konca jajca. Že majhna količina tekočine med kemičnimi snovmi in lupino povzroči popolno ločitev lupine v 1-2 dneh.
Po odstranitvi zarodka se membrana, ki obdaja jajce, večkrat spere s fiziološko raztopino, ohlajeno na 4-0 °C, dokler tekočina ne postane bistra. Nato v jajčno votlino vnesemo 20 ml hranilnega medija, segretega na 37 ° C, in jajce zapremo s sterilno gumijasto zaporko, ki smo jo predhodno potopili v parafin. Epruveta z gumijastim zamaškom, vstavljenim v jajce, omogoča zbiranje in dajanje tekočine brez nevarnosti bakterijske kontaminacije. Tak biološki objekt ostane sposoben preživetja več dni.
Po metodi Yoshina in drugih se votlina deembriniranih jajčec napolni z raztopino agarja v Hanksovi raztopini. Deembrinirana jajčeca se okužijo preko cevke v pokrovčku.
Kontrolna vprašanja:
1. Zgradba piščančjega zarodka.
2. Zakaj se piščančji zarodki uporabljajo v virologiji?
3. Kakšna je zgradba razvijajočega se piščančjega zarodka?
Zarodke uporabljamo v starosti od 8 do 14 dni, odvisno od vrste virusa in načina okužbe. Razmnoževanje pri piščančjih zarodkih poteka v različnih delih zarodka: na horioalantoični membrani, v alotonični in amnijski membrani, rumenjaku, telesu zarodka.
Glede na tehniko priprave obstajajo 3 vrste celic:
Enoslojno steklo se lahko razmnožuje na površini kemično nevtralnega stekla v obliki monosloja;
Suspenzija, ki se razprostira po celotnem volumnu hranilnega medija;
Organi so celi deli organov in tkiv, ki ohranjajo svojo prvotno strukturo.
Priprava primarne celične kulture je sestavljena iz več stopenj: mletje tkiva, ločevanje celic in izpiranje nastale suspenzije iz tripsina.
Indikacija:
- citopatski učinek - morfološke spremembe v celicah, vidne pod mikroskopom, do zavrnitve iz stekla.
Virusni vključki so kopičenje virusnih delcev ali ločevanje virusnih komponent v citoplazmi ali jedru celice.
Plaki so omejena področja, sestavljena iz degenerativnih celic. Vidni so kot svetle lise na ozadju obarvanih celic.
Barvni test
Hemadsorpcija je sposobnost celičnih kultur, da adsorbirajo rdeče krvne celice na svoji površini.
motnje.
Bakteriofagi so bakterijski virusi, ki imajo sposobnost prodiranja v bakterijske celice in povzročijo njihovo raztapljanje. Imajo paglavčasto obliko, nekatere so kockaste niti. Sestavljeni so iz ikozaedrske glave in repa. Znotraj kavdalnega procesa je valjasta palica, zunaj je ovoj, proces se konča s šesterokotno bazalno ploščo s kratkimi trni. Fagi so sestavljeni iz nukleinske kisline in beljakovin. Pri fagih v obliki semenčic je dvoverižna DNA tesno zapakirana v vijačnici znotraj glave. Beljakovine so del lupine. Poleg strukturnih proteinov so odkrili notranje proteine, povezane z nukleinsko kislino in encimske proteine, ki sodelujejo pri interakciji faga s celico.
Število virulentnih fagov se lahko poveča samo skozi litični cikel. Proces interakcije med virulentnim bakteriofagom in celico je sestavljen iz več faz: adsorpcija bakteriofaga na celico, prodiranje v celico, biosinteza komponent faga in njihovo sestavljanje ter sproščanje bakteriofagov iz celice.
Sprva se bakteriofagi pritrdijo na za fage specifične receptorje na površini bakterijske celice. Rep faga s pomočjo encimov, ki se nahajajo na njegovem koncu (predvsem lizocima), lokalno raztopi celično membrano, se skrči in DNK, ki je v glavi, se vbrizga v celico, beljakovinska ovojnica bakteriofaga pa ostane zunaj. Vbrizgana DNK povzroči popolno prestrukturiranje metabolizma celice: sinteza bakterijske DNK, RNK in beljakovin se ustavi. DNK bakteriofaga se začne prepisovati s pomočjo lastnega encima transkriptaze, ki se aktivira po vstopu v bakterijsko celico. Najprej se sintetizirajo zgodnje in nato pozne mRNA, ki vstopijo v ribosome gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo zgodnji (DNA polimeraze, nukleaze) in pozni (kapsidni in repni proteini, encimi lizocim, ATPaza in transkriptaza) bakteriofagni proteini. Replikacija DNA bakteriofaga poteka po polkonzervativnem mehanizmu in se izvaja s sodelovanjem lastnih DNA polimeraz. Po sintezi poznih proteinov in zaključku replikacije DNK se začne končni proces – zorenje fagnih delcev oziroma združevanje fagne DNK z ovojnim proteinom in nastanek zrelih kužnih fagnih delcev.
Preberite tudi:
|
Mnogi virusi, ki okužijo ljudi in živali, se lahko v večji ali manjši meri razmnožijo v piščančjem zarodku. Prisotnost goste lupine ščiti zarodek pred mikroorganizmi iz zunanjega okolja.
Metoda gojenja virusov v piščančjih zarodkih se uporablja v laboratorijski diagnostiki virusnih okužb, pa tudi za proizvodnjo virusnih cepiv in diagnostičnih zdravil. Toda ta metoda ima slabosti: 1) nemogoče je opazovati dinamiko patoloških sprememb, ki se pojavijo v zarodku po okužbi z virusom; 2) pri odpiranju zarodka, okuženega z virusom, pogosto ni vidnih sprememb in je treba odkriti prisotnost virusa v tkivih in tekočinah zarodka z drugimi virološkimi metodami (na primer reakcija hemaglutinacije); 3) metoda gojenja v piščančjih zarodkih ni primerna za vse viruse. Kljub obstoječim pomanjkljivostim je metoda razmeroma enostavna, priročna in poceni ter se pogosto uporablja v viroloških študijah. Najpomembnejša je pri delu z ortomiksovirusi, herpesvirusi in poksvirusi.
1.3.1. Struktura piščančjega zarodka
Piščančji zarodek je prekrit z apnenčasto lupino - lupino, na katero se od znotraj prilega membrana lupine. Na topem koncu jajčeca se razcepi in vsebuje zračni prostor. Pod lupinsko membrano se nahaja horioalantoična membrana, ki poteka vzdolž notranje strani lupine, ta membrana je bogata s krvnimi žilami in služi kot dihalni organ zarodka. Na njej z notranje strani meji alantoična votlina, ki je izločevalni organ in ščiti zarodek pred izsušitvijo in poškodbami. Alantoična votlina obdaja zarodek, ki se nahaja v amnijski votlini, ki je napolnjena z amnijsko tekočino. Preko rumenjakove vrvice je zarodek povezan z rumenjakovim mešičkom, glavnim virom hranil.
Uspešno gojenje virusov v telesu razvijajočih se piščančjih zarodkov zahteva določeno temperaturni režim(36 0 -38 0), vlažnost (50-70 %), pa tudi ustrezno prezračevanje. Okužijo se piščančji zarodki določene starosti, inkubirajo se od 6 do 13 dni, odvisno od vrste virusa in načina okužbe. Pripraviti je treba: stojalo za jajca, viali z alkoholom in jodom, epruveto s sterilnim parafinom, pokrovna stekelca, vrečke iz sterilne vate in gaze, sterilne posode, zavite v papir, sterilne brizge, igle, pincete, disekcijske igle. Instrumente damo v kozarec z alkoholom, kjer ostanemo ves čas dela, pred vsako manipulacijo jih dodatno steriliziramo s kurjenjem v plamenu gorilnika. Pred delom si temeljito umijte roke, priporočljivo je, da nosite masko iz gaze.
Preživetje sposobne zarodke izberemo za delo s pregledom inkubiranih jajčec v ovoskopu. Zarodek, ki je sposoben preživeti, je gibljiv, krvne žile membrane so napolnjene s krvjo. Izbrana jajca na topem koncu (ali na strani jajca) temeljito razkužimo: lupino obrišemo z alkoholom, namažemo z jodom, ponovno obdelamo z alkoholom in žgemo.
1.3.2. Okužba piščančjega zarodka na horioalantoični membrani
Za okužbo se uporabljajo piščančji zarodki, stari 10-12 dni. Glavne stopnje okužbe:
1. Jajce postavimo na stojalo v navpični položaj, tako da je zračna blazina zgoraj, lupino pa steriliziramo na topem koncu jajca.
2. Z disekcijsko iglo naredimo punkcijo lupine nad sredino zračnega mešička.
3. Čeljust škarij vstavimo v nastalo luknjo in v lupini izrežemo okence s premerom približno 1,5 cm.
4. Skozi luknjo z iglo previdno odtrgajte notranji list lupine in ga odlepite majhno območje(0,5-1 cm2).
5. Horioalantoisna membrana se okuži tako, da se nanjo s Pasteurjevo pipeto ali brizgo nanese 0,1-0,2 ml materiala, ki vsebuje virus.
6. Okence v lupini je prekrito s posebnim elastičnim filmom ali sterilnim pokrovnim steklom in pritrjeno s staljenim parafinom.
Okužene zarodke postavimo v termostat v navpičnem položaju in inkubiramo 2-3 dni, nato pa opravimo obdukcijo po naslednjih pravilih:
1. Jajce postavimo na stojalo tako, da je zračni prostor na vrhu, mesto odprtine pa steriliziramo.
2. S sterilnimi škarjami odrežite lupino vzdolž meje zračnega prostora.
3. S pinceto odstranite lupino ob robu. Razgaljena horioalantoična membrana je obrezana vzdolž roba lupine. Skozi nastalo luknjico v skodelico ali pladenj vlijemo celotno vsebino jajčka.
4. Horioalantoisno membrano, ki ostane znotraj lupine, previdno odstranimo s pinceto in damo v sterilno skodelico s fiziološko raztopino. Tu jo poravnajo in preučujejo spremembe tako, da skodelico postavijo na temno podlago.
Da bi dobili material, ki vsebuje virus iz horioalantoične membrane, ga je treba zdrobiti s škarjami in nato zmleti v možnarju s kremenčevim steklom ter dodati fiziološka raztopina. Nastalo suspenzijo centrifugiramo pri 2000 obratih na minuto 10-15 minut in supernatant uporabimo kot material, ki vsebuje virus.
riž. 3. Okužba piščančjih zarodkov
1.3.3. Okužba v alantoični votlini
Za okužbo se vzamejo zarodki, stari 10-11 dni. Glavne stopnje okužbe:
1. Jajce postavimo na stojalo s topim koncem navzgor in lupino steriliziramo nad zračnim prostorom.
2. Z disekcijsko iglo se naredi vbod v lupino na sredini topega konca.
3. V luknjo se vstavi igla brizge, ki vsebuje razredčino virusa. Igla se pomakne v navpični smeri 2-3 mm pod nivo zračnega mešička in nato se injicira 0,1-0,2 ml materiala.
4. Luknjo v lupini zalepimo s stopljenim sterilnim parafinom.
Okužene zarodke hranimo v termostatu običajno 2 dni. Pred odpiranjem jajca čez noč postavimo v hladilnik pri 4 0 C. Odpiranje poteka po naslednjem vrstnem redu:
1. Jajce postavimo na stojalo tako, da je zračna blazina na vrhu, lupina nad njo je sterilizirana.
2. S škarjami se lupina odreže nekoliko nad mejo zračnega prostora.
3. S pinceto previdno odstranimo lupinasto membrano, nakar s Pasteurjevo pipeto preluknjamo horioalantoisno membrano na mestu, kjer ni žil, in posesamo alantoično tekočino.
4. Alantoično tekočino prenesemo v sterilno epruveto in del nje nacepimo v juho, da preverimo bakteriološko sterilnost.
